糖尿病大鼠螺旋神經(jīng)節(jié)細胞和蝸核神經(jīng)元自噬與凋亡的時序性變化與機制探討.pdf

1、目的和意義：
　　糖尿病對聽覺系統(tǒng)可造成不同程度的損害，目前發(fā)生機制尚不明確。研究發(fā)現(xiàn)，自噬和凋亡與糖尿病及其并發(fā)癥，如糖尿病腎病、糖尿病神經(jīng)病變、糖尿病視網(wǎng)膜病變等有關(guān)并起重要作用，然而在糖尿病聽力損害的研究鮮見報道。我們推斷自噬在糖尿病聽力損害中也同樣發(fā)揮作用。本實驗建立糖尿病大鼠模型，研究糖尿病對聽覺系統(tǒng)的時序性病理改變，探討自噬和凋亡是否參與高血糖對螺旋神經(jīng)節(jié)細胞和蝸核神經(jīng)元的毒性過程及相關(guān)信號通路，為研究糖尿病聽力損害的

2、發(fā)病機制提供實驗依據(jù)。
　　方法：
　　制備糖尿病模型，在糖尿病第4、8、12周末，檢測大鼠畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射(distortion product otoacoustic emision，DPOAE)和聽性腦干反應(auditory brainstem response，ABR)。觀察各組糖尿病大鼠螺旋神經(jīng)節(jié)細胞(spiral ganglion cells，SGCs)的形態(tài)學變化，進行SGCs計數(shù)。透射電鏡觀察蝸神經(jīng)、坐骨神

3、經(jīng)、SGCs和蝸核神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)。采用免疫組化法檢測蝸核膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）的表達，免疫組化和免疫印跡法檢測SGCs和蝸核神經(jīng)元LC3、Beclin-1、Bcl-2、bax和Cleaved Caspase-3蛋白的表達，并進行相關(guān)性分析。
　　結(jié)果：
　　1.成功制備糖尿病大鼠模型，造模成功率72.50％，死亡率23.57％。
　　2.聽功能檢測

4、結(jié)果:DM12W組大鼠DPOAE各頻率幅值均出現(xiàn)明顯下降。DM8W、DM12W組ABR的反應閾均升高，DM12W組各波潛伏期及波間期延長。
　　3.光鏡下見對照組與DM4W組SGCs與蝸核神經(jīng)元大體形態(tài)正常;DM8W、DM12W組SGCs與蝸核神經(jīng)元細胞密度降低，SGCs計數(shù)明顯減少(P＜0.05)。
　　4.超微結(jié)構(gòu)改變:蝸神經(jīng)在DM8W、DM12W組有髓神經(jīng)纖維減少，髓鞘萎縮、板層分離、斷裂;軸索萎縮，胞漿內(nèi)可見自噬溶酶

5、體。坐骨神經(jīng)在DM4W組可見部分髓鞘分離;DM8W、DM12W組髓鞘斷裂、分離多見，出現(xiàn)脫髓鞘，軸索萎縮、破裂。DM4W組SGCs內(nèi)線粒體出現(xiàn)少部分腫脹，DM8W、DM12W組線粒體腫脹、空泡化，自噬體及溶酶體增多，髓鞘板層分離。蝸核神經(jīng)元在DM4W組出現(xiàn)髓鞘板層松弛或斷裂，DM8W、DM12W組自噬體和溶酶體逐漸增多，髓鞘變形、板層分離、斷裂。
　　5.SGCs自噬和凋亡蛋白的表達:免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)Beclin-1、LC3、Ba

6、x與Cleaved Caspase-3在糖尿病組陽性表達多見，對照組少見，Bcl-2則相反。Western blotting檢測:各糖尿病組SGCs Beclin-1的表達均顯著上調(diào)(P＜0.05)。DM8W和DM12W組Cleaved-LC3、Bax與Cleaved Caspase-3的表達明顯高于對照組(P＜0.05)。Bcl-2的表達在DM8W組和DM12W組顯著下降。
　　6.蝸核神經(jīng)元蛋白的表達:免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)糖尿病組

7、GFAP陽性表達的星形膠質(zhì)細胞增多。Beclin-1、LC3、Bax與Cleaved Caspase-3在各糖尿病組陽性表達多見，對照組少見，Bcl-2則相反。Western blotting檢測Beclin-1、Bax在各糖尿病組表達升高，Cleaved-LC3蛋白在DM8W和DM12W組的表達明顯升高。DM4W組和DM8W組Cleaved Caspase-3表達上調(diào)。Bcl-2在DM8W組和DM12W組表達降低。
　　結(jié)論：<