硫酸卡那霉素慢性致聾大鼠螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞及蝸神經(jīng)背核神經(jīng)元退變時(shí)序性和機(jī)制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開(kāi)論述：
　　第一部分 硫酸卡那霉素慢性致聾大鼠螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞變性的時(shí)序性及機(jī)制研究
　　目的:建立硫酸卡那霉素慢性致聾大鼠模型。研究硫酸卡那霉素慢性致聾大鼠螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)動(dòng)態(tài)變化及其退變時(shí)程,探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)是否參與螺旋神經(jīng)節(jié)退變過(guò)程。
　　方法:選取耳廓反射正常,聽(tīng)力正常的成年大鼠為研究對(duì)象,大腿內(nèi)側(cè)皮下每天注射硫酸卡那霉素500mg/kg,連續(xù)注射10天。在給藥后第1,7,

2、14,28,56,70和140天觀察螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化和定量分析螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞密度變化,以及在給藥后的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè) Bip,IRE1α,caspase-12, Phospho-eIF2-alpha(Ser51),Phospho-PERK(Thr980),GADD153和ATF-6α的表達(dá),同時(shí)行 TUNEL染色。
　　結(jié)果:1、聽(tīng)功能:正常成年大鼠在4K,8K,16K,24K和32K Hz頻率的ABR平均閾值分別為2

3、4.00±3.16,20.50±4.38,25.00±5.77,30.50±5.50和34.00±3.94 dB SPL。在卡那霉素治療1,7,14,28,56,70和140天后,4KHz頻率 ABR平均閾值分別為37.00±10.33,37.50±13.79,57.00±8.24,60.00±11.06,72.00±8.56,48.00±9.78和50.00±11.55 dB SPL;8KHz頻率 ABR平均閾值分別為42.00±12

4、.51,40.50±11.17,52.00±11.35,63.00±9.19,81.00±8.43,56.50±5.80和57.00±14.18 dB SPL;16KHz頻率 ABR平均閾值分別為是59.00±11.50,58.00±11.83,64.50±6.85,67.00±11.35,83.50±5.30,66.00±12.43和61.50±19.59 dB SPL;24KHz頻率 ABR平均閾值分別是61.50±12.26,61

5、.00±9.66,73.50±9.14,80.50±5.99,86.00±5.68,76.50±11.80和68.50±15.64 dB SPL。在32KHz頻率平均閾值分別為71.50±6.69,67.50±11.37,80.50±8.96,81.00±7.75,86.50±6.26,75.50±9.56和75.00±13.33 dB SPL?？敲顾亟o藥后,除4KHz在1和7天外,各個(gè)頻率 ABR平均閾值在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)與正常對(duì)照組相比

6、均有顯著升高(P<0.001)。2、螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞計(jì)數(shù):對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組(給藥后1,7,14,28,56,70和140天)底回 SGN平均細(xì)胞密度分別為(/mm2)2334.06±169.62,2100.00±237.01,1664.47±139.45,1400.03±279.79,1334.66±85.96,1314.85±164.18,1166.43±41.69和1140.27±96.09。除卡那霉素給藥后1天外,對(duì)照組和各實(shí)驗(yàn)組之間

7、的SGC計(jì)數(shù)有顯著性差異(P<0.001)。3、SGC超微結(jié)構(gòu)變化:(I型)SGCs數(shù)量大幅減少,導(dǎo)致單個(gè)細(xì)胞之間的空間擴(kuò)大。大部分 SGCs變?yōu)闃?shù)突樣形狀及其細(xì)胞器和細(xì)胞內(nèi)容分布更加緊湊,表現(xiàn)出電子致密的外觀。同時(shí),核周體髓鞘變得更薄、更松弛。亞細(xì)胞水平形態(tài)結(jié)構(gòu)上,在卡那霉素給藥后早期,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張明顯及線粒體進(jìn)行性腫脹,隨后從給藥后28天至140天逐漸恢復(fù)。線粒體在卡那霉素給藥后出現(xiàn)局灶性空泡化。4、TUNEL染色:在卡那霉素給藥后7

8、,14和28天,TUNEL和caspase-12染色雙陽(yáng)性的SGCs細(xì)胞數(shù)明顯增多,并于給藥后第7天,TUNEL和caspase-12染色雙陽(yáng)性的SGCs細(xì)胞數(shù)升高最明顯。5、western blot分析:IRE1α的表達(dá)在給藥后7天(P<0.05),14天(P<0.01)和56天(P<0.05)顯著升高(P<0.05)。與對(duì)照組相比,BIP表達(dá)在給藥后1天到56天上調(diào)(P<0.05),而在140天下調(diào)(P<0.01)。GADD153蛋

9、白水平在給藥后1天顯著上調(diào)(P<0.05),持續(xù)至70天(P<0.05)并且在卡那霉素治療后70天達(dá)到最高水平(P<0.01)。其次,在與對(duì)照組相比,P-PERK蛋白水平從給藥后7天至140天上調(diào)(P<0.05),P-eIF2α蛋白水平從卡那霉素治療后1天至56天上調(diào)(P<0.05)。第三, ATF-6α表達(dá)在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中幾乎檢測(cè)不到。最后, Caspase-12的蛋白水平在給藥后1(P<0.01),7(P<0.01),14(P<0

10、.05)和56天(P<0.01)顯著上調(diào),而在140天下調(diào)(P<0.05)
　　結(jié)論:1、硫酸卡那霉素引起螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞退變是持續(xù)性的。2、ERS參與卡那霉素所致的SGCs凋亡過(guò)程。3、部分 SGCs凋亡是通過(guò) ERS引發(fā)的caspase-12和GADD153上調(diào)介導(dǎo)。
　　第二部分 硫酸卡那霉素慢性致聾大鼠蝸神經(jīng)背側(cè)核神經(jīng)元退變時(shí)序性及其機(jī)制研究
　　目的:硫酸卡那霉素慢性致聾大鼠后,檢測(cè)蝸神經(jīng)背核(DCN)梭形細(xì)胞

11、超微結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)病理變化,探討凋亡或自噬是否參與硫酸卡那霉素對(duì) DCN的神經(jīng)毒性過(guò)程。
　　方法:選取耳廓反射正常,聽(tīng)力正常的成年大鼠為研究對(duì)象,大腿內(nèi)側(cè)皮下每天注射硫酸卡那霉素500mg/kg,連續(xù)注射10天。給藥后第1,7,14,28,56,70和140天研究成年大鼠DCN梭形細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)病理變化和神經(jīng)元密度變化及神經(jīng)元凋亡情況;同時(shí)在給藥后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè) JNK1,DAPK2,Bcl-2,p-Bcl-2, Caspase

12、-3,LC3B和Beclin-1的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:1、聽(tīng)功能:正常成年大鼠在4K,8K,16K,24K和32K Hz頻率的ABR平均閾值分別為24.00±3.16,20.50±4.38,25.00±5.77,30.50±5.50和34.00±3.94 dB SPL。在卡那霉素治療1,7,14,28,56,70和140天后,4KHz頻率 ABR平均閾值分別為37.00±10.33,37.50±13.79,57.00±8.24,

13、60.00±11.06,72.00±8.56,48.00±9.78和50.00±11.55 dB SPL;8KHz頻率 ABR平均閾值分別為42.00±12.51,40.50±11.17,52.00±11.35,63.00±9.19,81.00±8.43,56.50±5.80和57.00±14.18 dB SPL;16KHz頻率 ABR平均閾值分別為是59.00±11.50,58.00±11.83,64.50±6.85,67.00±11

14、.35,83.50±5.30,66.00±12.43和61.50±19.59 dB SPL;24KHz頻率 ABR平均閾值分別是61.50±12.26,61.00±9.66,73.50±9.14,80.50±5.99,86.00±5.68,76.50±11.80和68.50±15.64 dB SPL。在32KHz頻率平均閾值分別為71.50±6.69,67.50±11.37,80.50±8.96,81.00±7.75,86.50±6.2

15、6,75.50±9.56和75.00±13.33 dB SPL?？敲顾亟o藥后,除4KHz在1和7天外,各個(gè)頻率 ABR平均閾值在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)與正常對(duì)照組相比均有顯著升高(P<0.001)。2、DCN梭形細(xì)胞超微結(jié)構(gòu):給藥后第1天到28天梭形細(xì)胞線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹逐漸加重,然后在給藥后第28到140天逐漸恢復(fù);線粒體局灶性空泡形成;同時(shí),在給藥后第1,7,14,28和56天自噬小體和自噬溶酶體明顯增多,隨后逐步恢復(fù),最后殘留為脂褐素。3、

16、神經(jīng)元密度計(jì)數(shù)和LC3陽(yáng)性神經(jīng)元細(xì)胞計(jì)數(shù):給藥后第1,7和14天,實(shí)驗(yàn)組的LC3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯高于對(duì)照組,而實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)元細(xì)胞密度與對(duì)照組相比沒(méi)有發(fā)生明顯變化。4、western blot分析:首先,JNK1的表達(dá)水平在給藥后第1天沒(méi)有明顯改變,但在第7天有顯著上調(diào)(P<0.05),隨后逐漸下調(diào)。第二,與對(duì)照組相比,DAPK2和caspase-3表達(dá)沒(méi)有明顯改變。第三, Bcl-2蛋白水平初始未發(fā)生變化,直至給藥后140天出現(xiàn)下調(diào)(P<0

17、.05)。p-Bcl2蛋白水平在給藥后1天未發(fā)生明顯上調(diào),但于第7天的時(shí)候達(dá)到最高峰(P<0.001),并持續(xù)到給藥后第28天(P<0.05)。最后,與對(duì)照組相比,Beclin-1在給藥后第1天顯著升高(P<0.05),在第7天達(dá)到最高峰(P<0.01),然后從給藥后第14天到140天下降,但這種下降趨勢(shì)并沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí),LC3在第7天顯著上調(diào)(P<0.01),從第14天開(kāi)始到140天下降到正常水平。5、TUNEL染色:與對(duì)照組相