Wip1、αB-crystallin和HspB2在心肌損傷中的作用研究.pdf

1、文章分為以下部分:
　　第一部分:Wip1基因缺失對小鼠心功能的影響
　　目的:野生型p53誘導(dǎo)的磷酸酶l(Wildtype p53-induced phosphatase1，Wip1)在很多疾病和生理過程中起著重要作用，但其在心臟中的作用尚未研究報道。本研究探討敲除Wip1基因?qū)π∈笮墓δ艿挠绊懠靶呐K組織中基因和蛋白表達(dá)水平的變化。
　　方法:隨機選取野生型(Wildtype，WT)小鼠和Wip1基因敲除(Wip1

2、knockout，Wip1-KO)小鼠各10只，分別檢測兩組小鼠的心功能和心臟重量/體重比，應(yīng)用蘇木精伊紅(Hematoxylin and eosin，HE)染色觀察小鼠心肌組織的病理形態(tài)，應(yīng)用實時定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time Polymerase ChainReaction，RT-PCR)檢測心肌組織中Wip1、心房利鈉肽(Atrial natriureticpeptide，ANP)、腦鈉肽(Brain natriur

3、etic peptide，BNP)、單核細(xì)胞趨化蛋白1(Monocyte chemoattractant protein，MCP-1)和α-平滑肌肌動蛋白(α-smoothmuscle actin，α-SMA)的基因表達(dá)水平，并應(yīng)用蛋白免疫印跡實驗(Western Blot)檢測凋亡相關(guān)蛋白包括B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma, Bcl-2)、B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2-associated X protei

4、n，Bax)和活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Cleaved caspase-3，c-caspase3）表達(dá)水平。
　　結(jié)果:與WT小鼠相比，Wipl-KO小鼠心肌組織中Wip1 mRNA表達(dá)明顯降低，左室射血分?jǐn)?shù)和縮短分?jǐn)?shù)降低，左心室收縮末期內(nèi)徑增大。雖然Wip1-KO小鼠的心臟重量與WT小鼠之間沒有差異，但Wipl-KO小鼠體重較WT小鼠減輕，心重/體重比增加。HE染色結(jié)果顯示W(wǎng)ip1-KO小鼠的心肌形態(tài)與WT小鼠之間沒有明顯

5、差異。心肌組織中ANP、BNP、MCP-1和α-SMA基因表達(dá)水平在兩組小鼠之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異。Wipl-KO小鼠心肌組織中凋亡相關(guān)蛋白Bax/Bcl-2和c-caspase3表達(dá)水平與WT小鼠之間沒有明顯差異。
　　結(jié)論:敲除Wip1基因可以損害小鼠心功能，但相關(guān)的機制還有待進一步闡明。
　　第二部分:敲除Wip1基因加重心肌梗死引起的缺血性損傷
　　目的:既往有很多關(guān)于Wip1在腫瘤和不同類型干細(xì)胞中調(diào)節(jié)作用的報道

6、，但Wip1在心肌梗死中的作用尚未有研究。本研究擬探討Wip1在心肌梗死中的作用以及可能的分子機制。
　　方法:通過永久性結(jié)扎小鼠左前降支冠狀動脈構(gòu)建心肌梗死模型。心肌梗死模型構(gòu)建成功后，持續(xù)觀察小鼠4周，統(tǒng)計小鼠生存率。應(yīng)用小鼠心臟超聲檢測系統(tǒng)評估小鼠心功能，通過測量小鼠心臟重量/體重比和麥胚凝集素(Wheat germagglutinin，WGA)染色檢測小鼠心臟肥厚情況，心肌組織切片后行HE染色評估小鼠心肌梗死面積，行Mas

7、son染色檢測小鼠心肌組織纖維增生情況。通過RT-PCR方法檢測小鼠心肌組織中白細(xì)胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）和膠原纖維Collagen I的基因表達(dá)水平，通過Western blot檢測小鼠心肌組織中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3(Signal transducers and a

8、ctivators of transcription3，stat3)、磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3(Phosphor-stat3，p-stat3)以及雷帕霉素靶蛋白(Mechanistic target of rapamycin，mTOR)底物激酶pS6的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:與WT小鼠相比，心肌梗死后Wipl-KO小鼠死亡率較高，心肌肥厚程度較重，心功能降低較明顯。HE染色結(jié)果顯示W(wǎng)ipl-KO小鼠心肌梗死面積較大，Masso

9、n染色顯示兩組小鼠的心肌纖維增生在術(shù)后均有增加，但兩組之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異，Collagen I的基因表達(dá)水平在兩組小鼠之間也沒有差異。RT-PCR結(jié)果表明Wip1-KO小鼠中IL-6 mRNA表達(dá)較低，而TNF-α mRNA和IL-1β mRNA的表達(dá)在兩組小鼠之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異。雖然心肌梗死后兩組小鼠的star3磷酸化均有增加，但Wip1-KO小鼠中p-stat3表達(dá)較低，兩組小鼠之間具有統(tǒng)計學(xué)差異。兩組小鼠之間pS6表達(dá)水平?jīng)]有統(tǒng)計

10、學(xué)差異。
　　結(jié)論:敲除Wip1基因可以加重心肌梗死引起的缺血損傷。
　　第三部分:α B-crystallin和HspB2在Tsc1基因敲除引起的心肌損傷中的作用
　　目的:既往研究報道αB晶體蛋白(α B-crystallin)在雷帕霉素靶蛋白(Mechanistic target of rapamycin，mTOR)活化誘導(dǎo)的細(xì)胞和動物模型中起著促進腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用。具有分子伴侶功能的α B-crystalli

11、n和HspB2都是小分子熱休克蛋白，可以輔助維持心臟穩(wěn)態(tài)。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)敲除Tsc1基因可以引起心臟增大等心肌損傷，而Tsc1基因敲除小鼠中α B-crystallin和HspB2表達(dá)上調(diào)。但α B-crystallin和HspB2在mTOR活化誘導(dǎo)的心肌損傷中有著怎樣的作用并不清楚。
　　方法:本課題共構(gòu)建心臟特異性敲除Tsc1基因小鼠(Tsc1 heartconditional-KO，T1-hKO)、α B-crysta

12、llin和HspB2雙基因敲除小鼠(Doubleknockout，dKO)、Tsc1，α B-crystallin和HspB2三基因敲除小鼠(Triple knockout，tKO)和對照小鼠(Control，CTLs)四種基因敲除小鼠。觀察四種基因型小鼠的生存率，應(yīng)用超聲評估小鼠的心功能，稱量小鼠體重和心臟重量，計算小鼠心臟重量/體重比，通過組織病理染色分析小鼠病理形態(tài)改變，應(yīng)用RT-PCR方法評估小鼠心肌組織中胚胎基因心房利鈉肽(A

13、trial natriuretic peptide，ANP)、腦鈉肽(Brainnatriuretic peptide，BNP)、α-骨骼肌肌動蛋白(α-skeletal actin，α-SKA)和β-肌球重鏈蛋白(β-myosin heavy chain，β-MHC)的表達(dá)水平，應(yīng)用HE染色評估小鼠心肌形態(tài)、WGA染色檢測小鼠心肌細(xì)胞面積、Masson染色觀察小鼠心臟纖維化程度，應(yīng)用電鏡觀察小鼠心肌超微結(jié)構(gòu)改變以及通過Western

14、blot檢測小鼠心肌組織中蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:敲除α B-crystallin和HspB2基因可以減少T1-hKO小鼠的死亡率。超聲結(jié)果顯示，T1-hKO小鼠心功能明顯下降，但敲除α B-crystallin和HspB2基因可以改善T1-hKO小鼠心功能。T1-hKO組小鼠心重/體重比增加，心肌細(xì)胞面積增大，tKO組小鼠的心肌細(xì)胞面積較Tl-hKO組小鼠減小。組織學(xué)染色分析發(fā)現(xiàn)T1-hKO組小鼠出現(xiàn)心肌細(xì)胞損傷，心臟纖維化增

15、加，而tKO組小鼠心肌細(xì)胞損傷減輕，心臟纖維化明顯緩解。心肌組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)結(jié)果顯示Tl-hKO組小鼠心肌細(xì)胞中線粒體結(jié)構(gòu)明顯異常，體積腫大，線粒體嵴數(shù)量減少、肌纖維變性、肌節(jié)連接異常，而tKO組小鼠中線粒體、肌纖維等結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)到正常狀態(tài)。T1-hKO組小鼠心肌組織中抗增殖細(xì)胞核抗原抗體(Proliferating cell nuclear antigen，PCNA)染色陽性部分強度明顯增加，說明細(xì)胞處于旺盛的增殖狀態(tài)，而tKO組小鼠