呼吸道合胞病毒復(fù)制相關(guān)宿主因子的高通量篩選及血小板因子4抗病毒機(jī)制研究.pdf

1、呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus，RSV）是感染人類的重要呼吸道病毒，主要感染兒童、老人及免疫力低下人群，可導(dǎo)致包括肺炎和支氣管炎在內(nèi)的嚴(yán)重呼吸道疾病，每年在全球造成3380萬感染病例和6.6～25.4萬死亡病例，是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致兒童死亡的主要原因之一。雖然針對RSV的疫苗和治療性抗體研究取得了一定進(jìn)展，但目前尚無商品化的疫苗和高效的抗病毒干預(yù)手段。研究病毒宿主因子有助于發(fā)現(xiàn)新的抗病毒靶點(diǎn)，是當(dāng)前領(lǐng)

2、域內(nèi)研究熱點(diǎn)和重點(diǎn)。目前對RSV在感染過程中如何影響宿主免疫防御已有一定了解，但對宿主因子在RSV感染中的作用研究較少，尤其缺乏在基因組水平上對RSV復(fù)制相關(guān)宿主因子的全面認(rèn)識。為了更全面闡釋RSV復(fù)制相關(guān)宿主因子及其功能，本研究基于含有10001個人類基因cDNA表達(dá)文庫的高通量篩選，分析影響RSV復(fù)制的宿主因子，發(fā)現(xiàn)59個宿主因子與RSV的復(fù)制相關(guān)，通過功能驗(yàn)證，對其中抑制病毒復(fù)制功能最強(qiáng)的血小板因子4(Platelet facto

3、r4，PF4)開展了深入的抗病毒功能與機(jī)制研究。
　　在RSV宿主限制因子篩選中，本研究將人eDNA表達(dá)文庫與高通量細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)相結(jié)合，用液體工作站和高內(nèi)涵顯微成像設(shè)備，通過免疫熒光分析病毒蛋白表達(dá)水平，在RSV感染細(xì)胞模型中實(shí)現(xiàn)外源基因的過表達(dá)和高通量篩選，分析與RSV復(fù)制相關(guān)的宿主因子。通過實(shí)驗(yàn)條件篩選，獲得了自動化、高通量和信噪比良好（6.7±0.3）的優(yōu)化研究體系，完成10001個人類基因cDNA的篩選。以RSVN蛋白熒光

4、信號強(qiáng)度為指標(biāo)，計(jì)算感染率并轉(zhuǎn)換為z score，z score的絕對值反映樣本的變異程度，其數(shù)值的正負(fù)反映變異的方向性。細(xì)胞數(shù)量z score≥-3的樣本為有效數(shù)據(jù)。以感染率z score=±2作為閾值，z score＞2的基因?yàn)閷SV復(fù)制有促進(jìn)作用，z score＜-2的為有抑制作用。篩選共獲得355個與RSV病毒復(fù)制相關(guān)的目標(biāo)基因，其中122個有正調(diào)控作用，233個有負(fù)調(diào)控作用。上述基因經(jīng)二次驗(yàn)證篩選，確定了細(xì)胞色素C氧化酶組裝

5、因子1同系物(COA1)、泛素樣修飾物激活酶1(UBA1)等10個基因具有正向調(diào)控病毒復(fù)制的作用，γ-干擾素(IFNG)、血小板因子4(PF4)等49個基因具有負(fù)調(diào)控作用。利用Western blot和RT-PCR方法對上述篩選后的基因進(jìn)行功能驗(yàn)證，確定其對RSV N基因的表達(dá)具有相應(yīng)的上調(diào)或下調(diào)作用。
　　在篩選發(fā)現(xiàn)的RSV限制性宿主因子中，PF4具有較高的病毒感染抑制率。PF4是一種分泌型表達(dá)的細(xì)胞因子，具有調(diào)節(jié)造血功能、促進(jìn)

6、凝血與創(chuàng)傷愈合、免疫調(diào)節(jié)、抗血管新生等多種生理功能，在腫瘤、移植排斥反應(yīng)和放化療導(dǎo)致的造血功能障礙治療中，PF4在動物模型中獲得了較好的效果。目前僅有兩個研究團(tuán)隊(duì)報道了PF4可抑制流感病毒和HIV復(fù)制，對其抗病毒功能的了解還十分有限。為了闡釋PF4抑制RSV病毒復(fù)制的功能機(jī)制，首先分析了臨床RSV感染嬰幼兒外周血PF4濃度，發(fā)現(xiàn)與無呼吸道感染人群對照比較，其血漿PF4濃度顯著增高(p＜0.001)。進(jìn)一步在細(xì)胞和動物水平對其分析對RSV

7、復(fù)制的作用機(jī)制。首先，通過在Hela細(xì)胞中轉(zhuǎn)染表達(dá)PF4蛋白，發(fā)現(xiàn)RSV N蛋白隨著PF4表達(dá)增加而降低，兩者存在劑量反應(yīng)關(guān)系，而信號肽缺失的非分泌型PF4突變體對RSV復(fù)制無影響;進(jìn)一步在HEp-2細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入重組人PF4蛋白后再感染RSV，發(fā)現(xiàn)病毒復(fù)制受到抑制，且抑制率與PF4濃度呈正相關(guān)。上述結(jié)果表明分泌型PF4蛋白具有抑制RSV復(fù)制的作用。為確定分泌型PF4對病毒復(fù)制的抑制作用針對于吸附還是穿入階段，在病毒吸附前、進(jìn)入階段

8、和進(jìn)入結(jié)束后分別給予PF4處理，發(fā)現(xiàn)只有在吸附前和進(jìn)入階段加入PF4蛋白才能下調(diào)細(xì)胞內(nèi)RSVN基因表達(dá)水平，在病毒吸附前加入PF4的病毒復(fù)制抑制作用能夠更強(qiáng)，提示PF4主要在RSV吸附階段發(fā)揮作用。PF4可高親和力結(jié)合多種糖胺聚糖，其中包括重要的RSV受體硫酸乙酰肝素（Heparan sμlphate，HS）。因此，推測PF4可能通過競爭性結(jié)合細(xì)胞表面HS而阻斷RSV對宿主細(xì)胞的吸附。通過將PF4蛋白與不同濃度的肝素混合后孵育HEp-2

9、細(xì)胞，棄去混合物后再用RSV感染細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)RSV感染率隨肝素濃度上升而增加，表明PF4對RSV感染的阻斷依賴于肝素與HS結(jié)合能力;免疫熒光共聚焦技術(shù)發(fā)現(xiàn)HS與PF4和RSV在細(xì)胞膜表面分別存在共定位，但PF4與RSV未見共定位，提示PF4結(jié)合HS后阻斷了RSV對HS的吸附，限制了病毒的進(jìn)入。用腸道病毒71(HS為其受體之一)和非HS受體依賴的流感病毒W(wǎng)SN為模型的研究，發(fā)現(xiàn)PF4對EV71的復(fù)制也具有抑制作用。以上結(jié)果表明PF4可通過結(jié)

10、合細(xì)胞表面受體HS，阻斷病毒吸附過程，發(fā)揮非特異性的抗病毒作用。在RSV小鼠感染模型中對PF4的抗病毒功能進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)感染RSV小鼠肺部和血漿PF4水平顯著升高(p=0.005);經(jīng)鼻給予PF4能顯著降低小鼠肺部RSV載量，減輕肺部病理損傷，下調(diào)氣道IL-6炎性因子的水平，表明PF4能通過抑制宿主體內(nèi)病毒復(fù)制減輕RSV的病理損傷。上述結(jié)果表明內(nèi)源性PF4在宿主抗RSV感染中可能具有重要作用。
　　本文通過功能獲得性高通量篩選技術(shù)