長鏈非編碼RNA GSTM3TV2調(diào)控胰腺癌化療耐藥的功能與機制研究.pdf

1、胰腺癌是一種臨床發(fā)現(xiàn)晚、惡性程度高和預(yù)后差的消化系統(tǒng)惡性腫瘤。手術(shù)切除是目前臨床上唯一可能治愈胰腺癌的方式，但根治性手術(shù)切除率僅為15-20％，絕大多數(shù)患者在初次就診時因腫瘤局部晚期或發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移已失去手術(shù)機會?；熓歉纳凭植窟M展期及轉(zhuǎn)移性胰腺癌患者預(yù)后的重要治療手段，然而胰腺癌患者易發(fā)生化療耐藥，以吉西他濱為基礎(chǔ)的單藥或聯(lián)合用藥方案并沒有大幅延長患者的總體生存時間。因此，尋找新的分子標記物以提高胰腺癌的早期診斷率、深入探索耐藥的分子機

2、制以提高胰腺癌的藥物治療效果，對于改善胰腺癌患者預(yù)后具有重要的意義。
　　長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類長度大于200個核苷酸而不能編碼蛋白質(zhì)的RNA，以其豐富的基因表達調(diào)控手段，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移、自噬、化療耐藥、干細胞維持及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）等多個方面發(fā)揮重要的調(diào)控作用。同時，鑒于ln

3、cRNA自身表達上的豐富性和組織表達上的特異性，腫瘤中表達失調(diào)的lncRNA可作為腫瘤早期診斷和預(yù)后判斷的分子標志物。研究表明lncRNA在胰腺癌中表達失調(diào)，并參與胰腺癌細胞的增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移、自噬、干細胞維持及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等多種腫瘤生物學(xué)表型的調(diào)控。但是其在胰腺癌化療耐藥中的調(diào)控作用及機制仍不完全明確。因此，深入研究lncRNA在胰腺癌化療耐藥中的調(diào)控作用和機制，對于揭示胰腺癌化療耐藥的分子機制具有重要的意義。
　　目的:

4、
　　檢測lncRNA在胰腺癌吉西他濱耐藥細胞株及親本株中的表達差異，構(gòu)建胰腺癌耐藥相關(guān)的競爭性內(nèi)源性RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)調(diào)控網(wǎng)絡(luò);篩選調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中潛在關(guān)鍵性lncRNA，初步探索潛在關(guān)鍵性lncRNA調(diào)控胰腺癌細胞化療耐藥作用及機制;并檢測潛在關(guān)鍵性lncRNA在胰腺癌組織中的表達，評估其與預(yù)后的價值。
　　方法:
　　通過高通量基因芯片檢測胰腺癌吉西他濱耐藥細胞株As

5、P C-1/GR和親本株AsPC-1中l(wèi)ncRNA、mRNA及microRNA的表達差異，建立耐藥相關(guān)lncRNA表達譜;通過生物信息學(xué)分析，構(gòu)建胰腺癌耐藥相關(guān)的競爭性內(nèi)源性RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò);篩選調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中潛在關(guān)鍵性lncRNA，并預(yù)測其參與調(diào)控化療耐藥的可能作用及機制;選取預(yù)測的潛在關(guān)鍵性lncRNA作為研究對象，利用原位雜交技術(shù)檢測其在180例臨床手術(shù)標本中的表達，評估潛在關(guān)鍵性lncRNA的表達水平與患者預(yù)后的相關(guān)性;在胰腺癌細胞中

6、上調(diào)/下調(diào)潛在關(guān)鍵性lncRNA的表達水平，采用CCK-8法、流式細胞術(shù)、Transwell法等探索潛在關(guān)鍵性lncRNA對胰腺癌細胞化療敏感性、增殖、凋亡、侵襲及遷移等的調(diào)控作用;構(gòu)建穩(wěn)定過表達的潛在關(guān)鍵性lncRNA的胰腺癌細胞株，建立裸鼠移植瘤模型，評估其在體內(nèi)對腫瘤生長和化療藥物治療的作用;通過RNA結(jié)合蛋白免疫共沉淀和雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炋剿鳚撛陉P(guān)鍵性lncRNA調(diào)控化療耐藥的機制及其作用的靶基因，Western blot檢

7、測關(guān)鍵性lncRNA及其靶基因所調(diào)控信號通路的變化情況。
　　結(jié)果:
　　1、胰腺癌吉西他濱耐藥相關(guān)lncRNA表達譜的建立
　　通過高通量lncRNA芯片檢測，發(fā)現(xiàn)在胰腺癌吉西他濱耐藥株AsPC-1/GR和其親本株AsPC-1之間有1897個耐藥相關(guān)lncRNA存在表達差異(fold change＞1.5，P＜0.05)，其中963條lncRNAs表達升高和934條lncRNAs表達降低，而長鏈非編碼RNA谷胱甘肽-

8、S-轉(zhuǎn)移酶μ3轉(zhuǎn)錄本2（Homo sapiens glutathione S-transferase mu3,transcript variant2,non-coding RNA,NR_024537.1,GSTM3TV2)呈顯著性表達升高(fold change＞104.52);并以此構(gòu)建了胰腺癌耐藥相關(guān)的競爭性內(nèi)源性RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
　　2、生物信息學(xué)分析結(jié)果
　　通過對耐藥相關(guān)的競爭性內(nèi)源性RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進行分析，發(fā)現(xiàn)l

9、ncRNAGSTM3TV2在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)為潛在關(guān)鍵性lncRNA，其可能通過競爭性內(nèi)源性RNA機制，競爭性結(jié)合let-7，調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中GLO1、KLK6、LAT2、OLR1及PARM1等的表達，從而介導(dǎo)胰腺癌化療耐藥的發(fā)生。
　　3、LncRNA GSTM3TV2在胰腺癌組織中的表達檢測
　　通過原位雜交法檢測lncRNA GSTM3TV2在180例胰腺癌組織及癌旁組織中的表達，發(fā)現(xiàn)GSTM3TV2在胰腺癌組織中的表達水平顯著高于

10、癌旁組織(P=0.000);而GSTM3TV2主要在細胞漿表達，細胞核未見表達。胰腺癌組織中GSTM3TV2的表達水平與腫瘤的N分期(P=0.007)和TNM分期(P=0.003)存在顯著相關(guān)性。單因素生存分析，發(fā)現(xiàn)GSTM3TV2的表達水平(P=0.004)、腫瘤分化程度(P=0.035)、T分期(P=0.008)、N分期(P=0.000)及TNM分期(P=0.000)與患者預(yù)后相關(guān)。多因素生存分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤分化程度(Low)、TNM

11、分期(Ⅱ/Ⅲ)及組織GSTM3TV2表達水平(High)是胰腺癌患者預(yù)后不良的獨立危險因素（P值分別為P=0.008，HR=1.706，95％CI：1.147-2.537;P=0.003,HR=2.786,95％CI：1.149-5.470;P=0.036,HR=1.466,95％CI：1.025-2.096)。
　　4、LncRNA GSTM3TV2對胰腺癌細胞惡性表型的調(diào)控作用
　　體外實驗發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌細胞AsPC-1

12、、MIAPaCa-2中上調(diào)GSTM3TV2可降低胰腺癌細胞對吉西他濱及白蛋白紫杉醇的化療敏感性，減少吉西他濱及白蛋白紫杉醇誘導(dǎo)發(fā)生的細胞凋亡，并促進胰腺癌細胞增殖、侵襲及遷移，抑制細胞凋亡等;反之，在胰腺癌細胞AsPC-1/GR、MIAPaCa-2/GR中抑制GSTM3TV2的表達則觀察到相反的實驗結(jié)果(P＜0.05)。體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定過表達GSTM3TV2的實驗組促進腫瘤的生長和降低腫瘤對吉西他濱及白蛋白紫杉醇治療的敏感性(P＜0.

13、05)。
　　5、LncRNA GSTM3TV2調(diào)控let-7的表達介導(dǎo)胰腺癌細胞化療耐藥
　　實時定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌細胞中上調(diào)或下調(diào)GSTM3TV2的表達后可顯著抑制或促進胰腺癌細胞中l(wèi)et-7的表達(P＜0.05)。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灠l(fā)現(xiàn)共轉(zhuǎn)染let-7mimics和let-7結(jié)合位點野生型的GSTM3TV2載體質(zhì)粒顯著降低293A細胞中的熒光素酶活性(P＜0.05)，而共轉(zhuǎn)染let-7mimics和let

14、-7結(jié)合位點突變型的GSTM3TV2載體質(zhì)粒對熒光素酶活性無影響，間接證明GSTM3TV2可與let-7相結(jié)合。RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀實驗發(fā)現(xiàn)，與對照組及轉(zhuǎn)染let-7結(jié)合位點突變型GSTM3TV2載體質(zhì)粒組相比，在胰腺癌細胞中轉(zhuǎn)染let-7結(jié)合位點野生型GSTM3TV2載體質(zhì)粒組中l(wèi)et-7的表達顯著升高(P＜0.05)，直接證明GSTM3TV2可與let-7相結(jié)合。Western blot檢測顯示，在胰腺癌細胞中上調(diào)或下調(diào)GSTM3

15、TV2的表達后上調(diào)或下調(diào)let-7靶基因K-Ras、c-Myc及HMGA2的表達水平，進一步說明GSTM3TV2可調(diào)控胰腺癌細胞中l(wèi)et-7的表達水平。同時，在穩(wěn)定過表達GSTM3TV2的胰腺癌細胞中促進let-7的表達，可顯著增加胰腺癌細胞對吉西他濱的化療敏感性(P＜0.05)，并顯著增加細胞對吉西他濱誘導(dǎo)發(fā)生的凋亡(P＜0.05)，抑制let-7靶基因K-Ras、c-Myc及HMGA2等的表達，說明LncRNA GSTM3TV2調(diào)控

16、胰腺癌細胞化療敏感性依賴于let-7的表達水平。
　　6、LncRNA GSTM3TV2調(diào)控LAT2、OLR1的表達介導(dǎo)胰腺癌細胞化療耐藥
　　Real time PCR檢測發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌耐藥細胞中下調(diào)GSTM3TV2的表達后可顯著抑制胰腺癌細胞中LAT2、OLR1mRNA的表達(P＜0.05)。Western blot檢測顯示，在胰腺癌細胞中上調(diào)或下調(diào)GSTM3TV2的表達后可促進或抑制胰腺癌細胞中LAT2、OLR1在蛋白

17、水平的表達。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實LAT2、OLR1為let-7的下游靶基因(P＜0.05)，說明GSTM3TV2可通過競爭性結(jié)合let-7，從而調(diào)控LAT2、OLR1的表達。而在胰腺癌細胞中抑制LAT2、OLR1的表達后，可增加細胞對吉西他濱的化療敏感性(P＜0.05)和增加細胞對吉西他濱誘導(dǎo)發(fā)生的凋亡(P＜0.05)，說明LAT2、OLR1可調(diào)控胰腺癌細胞的化療敏感性。
　　結(jié)論：
　　長鏈非編碼RNA GSTM3T

18、V2可通過競爭性內(nèi)源性RNA機制，競爭性結(jié)合let-7，上調(diào)let-7的靶基因K-Ras、c-Myc、HMGA2、LAT2及OLR1等表達，并激活PI3K/Akt、MAPK及STAT3信號通路，從而參與胰腺癌細胞對吉西他濱化療耐藥的調(diào)控。LncRNA GSTM3TV2還可調(diào)控EGFR的表達，從而介導(dǎo)胰腺癌細胞對厄洛替尼的耐藥。LncRNA GSTM3TV2在胰腺癌組織中表達升高，GSTM3TV2表達升高是胰腺癌患者預(yù)后不良的獨立危險因素