miR-224對(duì)主動(dòng)脈管壁力學(xué)性質(zhì)的影響及其在夾層發(fā)生中的機(jī)制研究.pdf

1、研究目的:主動(dòng)脈夾層(aortic dissection，AD)是嚴(yán)重威脅人類生命健康的一類心血管系統(tǒng)疾病，因其發(fā)病具有急、險(xiǎn)、重的特點(diǎn)，發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)，受到了國(guó)內(nèi)外研究者的重視，因此迫切需要對(duì)疾病更深入的研究和認(rèn)識(shí)，然而其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。本課題擬通過(guò)臨床樣本分析及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，以血管microRNA-224的異常表達(dá)與主動(dòng)脈管壁的生物力學(xué)性質(zhì)為著眼點(diǎn)，深入探討主動(dòng)脈夾層發(fā)生發(fā)展的機(jī)制和干預(yù)策略，從基因與生物力學(xué)的層面為研

2、究主動(dòng)脈夾層的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)歸提供科學(xué)性的理論依據(jù)。同時(shí)，本研究將可能為主動(dòng)脈夾層的早期診斷、預(yù)防和治療提供新的靶標(biāo)和策略。
　　研究方法:通過(guò)生物信息學(xué)檢索發(fā)現(xiàn)miR-224對(duì)多種主動(dòng)脈管壁力學(xué)相關(guān)基因、蛋白具有調(diào)控作用，篩選并確定以miR-224為研究靶標(biāo)并進(jìn)一步驗(yàn)證其與主動(dòng)脈管壁生物力學(xué)性質(zhì)變化的關(guān)系。首先，在符合倫理學(xué)審查及患者知情同意前提下，采集正常捐獻(xiàn)者主動(dòng)脈組織6例，胸主動(dòng)脈夾層患者主動(dòng)脈6例;對(duì)所有主動(dòng)脈組織樣本按照

3、標(biāo)準(zhǔn)流程提取總RNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)樣本中miR-224表達(dá)含量;而后將主動(dòng)脈組織精細(xì)切割成長(zhǎng)約15mm的啞鈴狀式樣，進(jìn)行單軸力學(xué)拉伸測(cè)試，獲得應(yīng)力應(yīng)變曲線，極限應(yīng)力，極限應(yīng)變等力學(xué)指標(biāo)，并比較miR-224表達(dá)含量與主動(dòng)脈管壁力學(xué)性質(zhì)變化的關(guān)系;為進(jìn)一步驗(yàn)證干預(yù)miR-224表達(dá)后主動(dòng)脈管壁生物力學(xué)性質(zhì)的變化情況，采用飲食中添加β-氨基丙腈及皮下植入血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)微泵的FVB小鼠建立

4、主動(dòng)脈夾層模型，通過(guò)尾靜脈注射miR-224Agomir/antagomir15OD/只，分別設(shè)立空白對(duì)照組、普通造模組、miR-224上調(diào)表達(dá)組、miR-224上調(diào)對(duì)照組、miR-224下調(diào)表達(dá)組、miR-224下調(diào)對(duì)照組，研究miR-224對(duì)血管重構(gòu)和主動(dòng)脈管壁生物力學(xué)性質(zhì)的影響;實(shí)驗(yàn)結(jié)束處死小鼠，解剖分離小鼠主動(dòng)脈，并在大體解剖層面觀察統(tǒng)計(jì)主動(dòng)脈夾層病變發(fā)生情況，將小鼠主動(dòng)脈分為4段，4％多聚甲醛固定石蠟包埋切片，HE染色測(cè)量小鼠

5、主動(dòng)脈管壁厚度(Aortic wallthickness); EVG染色比較小鼠主動(dòng)脈彈力纖維變化，Masson染色檢測(cè)小鼠主動(dòng)脈膠原纖維變化;通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)驗(yàn)證干預(yù)miR-224后表達(dá)含量;免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)力學(xué)相關(guān)蛋白R(shí)ho、ROCK1、SMAD表達(dá)變化;采用Electroforce5500動(dòng)態(tài)力學(xué)試驗(yàn)機(jī)對(duì)小鼠主動(dòng)脈管壁進(jìn)行單軸拉伸力學(xué)測(cè)試，記錄并比較應(yīng)力(Stress)、應(yīng)變(Strain)、極限應(yīng)力（Failure S

6、tress）、極限應(yīng)變(Failure Strain)、獲得應(yīng)力應(yīng)變曲線（stress-strain curve）計(jì)算彈性模量(Elastic modulus)及剛度(Stiffness)等力學(xué)參數(shù)，通過(guò)線性擬合分析不同應(yīng)變條件下對(duì)應(yīng)彈性模量的變化情況，計(jì)算應(yīng)力-應(yīng)變曲線下面積(AUC)，研究并明確干預(yù)miR-224對(duì)主動(dòng)脈管壁力學(xué)性質(zhì)變化的影響。
　　結(jié)果:臨床樣本研究，我們通過(guò)RT-PCR技術(shù)在胸主動(dòng)脈夾層患者(n=6)與遺體

7、捐獻(xiàn)者（正常人）(n=6)樣本上進(jìn)行差異表達(dá)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-224在主動(dòng)脈夾層患者表達(dá)呈現(xiàn)顯著上調(diào)特征(P＜0.05)，分別對(duì)主動(dòng)脈夾層患者及正常捐獻(xiàn)者主動(dòng)脈進(jìn)行單軸拉伸力學(xué)測(cè)試，結(jié)果表明，夾層組較正常組極限荷載，極限位移，極限應(yīng)力、極限應(yīng)變明顯降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)初始彈性模量(Initial elasticmodule)夾層組較正常組顯著降低(P＜0.01)，極限彈性模量(Maxl elastic module)

8、兩組間無(wú)明顯差異(P＞0.05);動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:造模后主動(dòng)脈夾層發(fā)生率分別為，空白對(duì)照組(n=0/11，0)、普通造模組(5/12，41.67％)、miR-224下調(diào)組(3/12，25％)、miR-224下調(diào)對(duì)照組(4/12，33.32％)、miR-224上調(diào)組(6/11，54.54％)、miR-224上調(diào)對(duì)照組(5/11，45.45％)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，miR-224上調(diào)組小鼠主動(dòng)脈夾層發(fā)生率較普通造模組顯著增高(6/11 vs5/1

9、2，P＜0.01) miR-224下調(diào)組小鼠主動(dòng)脈夾層發(fā)生率較普通造模組顯著降低(3/12 vs5/12，P＜0.01);通過(guò)qRT-PCR驗(yàn)證表明mir-224agomir可顯著促進(jìn)小鼠主動(dòng)脈miR-224的表達(dá)mir-224 antagomir可顯著抑制小鼠主動(dòng)脈miR-224的表達(dá)(P＜0.05);對(duì)小鼠主動(dòng)脈管壁進(jìn)行力學(xué)測(cè)試結(jié)果顯示:較空白對(duì)照組，主動(dòng)脈夾層造模組、miR-224上調(diào)、miR-224上調(diào)對(duì)照組、miR-224下調(diào)

10、組、miR-224下調(diào)對(duì)照組主動(dòng)脈管壁厚度明顯增厚(P＜0.05)，上調(diào)組較下調(diào)組管壁平均厚度顯著增加(P＜0.05)，miR-224低表達(dá)較miR-224高表達(dá)能夠提高主動(dòng)脈管壁的極限荷載、極限應(yīng)力、初始彈性模量、極限彈性模量，應(yīng)力-應(yīng)變曲線下面積(AUC)平均值，但是極限位移、拉伸比管壁平均周長(zhǎng)兩組間無(wú)明顯差異(P＞0.05); EVG染色分析提示上調(diào)miR-224較對(duì)照組使小鼠主動(dòng)脈彈力纖維減少，結(jié)構(gòu)紊亂，甚至斷裂，Masson染

11、色分析表明miR-224下調(diào)可增加小鼠主動(dòng)脈彈力纖維及膠原纖維含量，這表明下調(diào)miR-224在夾層發(fā)生中具有保護(hù)性作用，而免疫組化結(jié)果提示小鼠主動(dòng)脈組織中miR-224上調(diào)組較對(duì)照組其力學(xué)相關(guān)Rho、ROCK1、SMAD等信號(hào)表達(dá)明顯增強(qiáng)(P＜0.05)。
　　結(jié)論:我們首次探討了miR-224在主動(dòng)脈夾層中表達(dá)的差異性同管壁生物力學(xué)性質(zhì)之間的聯(lián)系，明確了其與夾層發(fā)生中的關(guān)系，并在此基礎(chǔ)上通過(guò)動(dòng)態(tài)力學(xué)測(cè)試儀進(jìn)行了人主動(dòng)脈樣本生物力

12、學(xué)性質(zhì)的檢測(cè)，RT-PCR驗(yàn)證得出miR-224在主動(dòng)脈夾層患者中呈高表達(dá)，同時(shí)我們測(cè)得人主動(dòng)脈夾層患者的管壁力學(xué)各項(xiàng)指標(biāo)如管壁厚度、初始彈性模量、極限應(yīng)力、極限應(yīng)變等較正常組織捐獻(xiàn)者明顯降低，提示miR-224高表達(dá)及主動(dòng)脈管壁力學(xué)性質(zhì)的差異與主動(dòng)脈夾層形成關(guān)系密切。進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，干預(yù)上調(diào)miR-224基因表達(dá)后小鼠主動(dòng)脈夾層的發(fā)生率明顯增高，而下調(diào)miR-224表達(dá)后夾層發(fā)生率明顯降低，并且提示miR-224為主動(dòng)脈夾層