microRNA對(duì)冠心病疑似致病基因LPPR4表達(dá)調(diào)控的初步研究.pdf

1、冠狀動(dòng)脈性心臟病簡稱冠心病(Coronary Artery Disease，CAD)在全世界范圍造成嚴(yán)重的醫(yī)療和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。男性發(fā)病年齡在55歲之前，女性在65歲之前的CAD稱為早發(fā)冠心病(Early Onset Coronary Artery Disease，EOCAD)，遺傳因素在EOCAD發(fā)病中起到的作用尤為突出。收集了一個(gè)呈常染色體顯性遺傳的漢族早發(fā)冠心病家系，前期工作中通過全外顯子組測(cè)序定位了LPPR4基因3'UTR區(qū)單堿基缺失

2、突變可能是該家系的致病基因，并發(fā)現(xiàn)該突變導(dǎo)致了LPPR4蛋白表達(dá)下調(diào)?？紤]到3'UTR區(qū)轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控與microRNA的關(guān)系，為了探究本家系患者早發(fā)冠心病的病理機(jī)制，需首先探明LPPR4基因表達(dá)是否通過miRNA進(jìn)行調(diào)控。通過靶點(diǎn)預(yù)測(cè)網(wǎng)站檢索發(fā)現(xiàn)候選變異正好位于miR-450a的識(shí)別位點(diǎn)中，此外既往文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-103a及miR-155-5p與冠心病密切相關(guān)，通過miRNA-DNA的靶效關(guān)系分析它們有可能與LPPR43'UTR區(qū)產(chǎn)生

3、作用。
　　研究目的：
　　了解目標(biāo)3種miRNA與LPPR4基因蛋白表達(dá)及生理表型關(guān)系，明確目標(biāo)miRNA是否與LPPR4基因3'UTR片段發(fā)生相互作用，初探后續(xù)調(diào)控表達(dá)相關(guān)機(jī)制。
　　研究方法：
　　考慮到miRNA的效應(yīng)與其在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)豐度密切相關(guān)，首先行qPCR測(cè)定目標(biāo)3種miRNA在包括血管平滑肌細(xì)胞在內(nèi)的兩種細(xì)胞系內(nèi)的基線豐度。之后行干預(yù)實(shí)驗(yàn)，通過轉(zhuǎn)染miRNA mimics后測(cè)定LPPR4蛋白表達(dá)

4、量變化，以及行transwell試驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞遷移變化，證實(shí)目標(biāo)miRNA確與LPPR4表達(dá)調(diào)控相關(guān)。隨后建立含有野生/突變型LPPR43'UTR區(qū)突變位點(diǎn)序列的熒光報(bào)告基因檢測(cè)質(zhì)粒，通過luciferase實(shí)驗(yàn)證明目標(biāo)miRNA是通過與LPPR4基因3'UTR區(qū)前80位堿基序列結(jié)合而發(fā)揮起調(diào)控作用的。最后利用RNA聚合酶Ⅱ強(qiáng)抑制劑放線菌素D對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)錄，隨即轉(zhuǎn)染miRNA mimics，在不同時(shí)間點(diǎn)裂解細(xì)胞，行qPCR測(cè)

5、定LPPR4mRNA水平隨時(shí)間推移的變化，以確定miRNA與LPPR4基因3'UTR區(qū)結(jié)合后是否通過影響mRNA穩(wěn)定性實(shí)現(xiàn)調(diào)控。
　　研究結(jié)果：
　　qPCR結(jié)果顯示三種miRNA中miR-103a相對(duì)豐度最高。在miRNA干預(yù)實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)染了miR-103a及miR-450-5p mimics，行蛋白免疫印跡及transwell試驗(yàn)示高水平miR-450-5p對(duì)LPPR4基因的表達(dá)可能起下調(diào)作用，而miR-103a對(duì)LPPR4

6、基因的表達(dá)可能起上調(diào)作用。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)表明這兩種miRNA與3'UTR區(qū)的確產(chǎn)生了相互作用，后續(xù)mRNA穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中miR-103a組LPPR4mRNA降解率較對(duì)照組出現(xiàn)了下調(diào)，而miR-450-5p組和對(duì)照組間未發(fā)現(xiàn)顯著差異。
　　研究結(jié)論：
　　1.高水平miR-103a會(huì)上調(diào)LPPR4蛋白表達(dá)，并抑制血管平滑肌細(xì)胞的遷移;而miR-450-5p則下調(diào)LPPR4蛋白表達(dá)，并促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞發(fā)生遷移。
　　2.m