Hnf1β和Foxa3四環(huán)素誘導(dǎo)型表達(dá)載體介導(dǎo)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化獲得肝干細(xì)胞及其相關(guān)分子機(jī)制.pdf

1、分化成熟的體細(xì)胞不經(jīng)過中間的多能性狀態(tài)而直接通過轉(zhuǎn)分化轉(zhuǎn)變成其他類型的體細(xì)胞或者成體干細(xì)胞的過程稱作譜系重編程。在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MouseEmbryonic Fibroblast cells，MEFs)中表達(dá)肝臟器官發(fā)生中起重要作用的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子Hnf1β和Foxa3，將其誘導(dǎo)為肝干細(xì)胞(induced hepatic stem cells，iHepSCs)的成功，是該研究領(lǐng)域的一項(xiàng)重要成果，然而其重編程過程中所涉及的分子機(jī)制卻尚

2、不清楚。
　　四環(huán)素控制的誘導(dǎo)型表達(dá)載體是研究重編程進(jìn)程的非常有用的工具。2008年，Brambrink和Stadtfeld就曾經(jīng)利用這個(gè)體系揭示了MEF重編程為iPSCs細(xì)胞的時(shí)間進(jìn)程，他們從整合了Oct4-GFP等位基因及四環(huán)素控制元件反式作用因子基因M2rtTA的小鼠中分離MEF細(xì)胞，該小鼠所攜帶的GFP報(bào)告基因可以顯示內(nèi)源性O(shè)ct4基因的激活情況，并表示細(xì)胞重編程的成功。借鑒體細(xì)胞重編程機(jī)制研究的經(jīng)驗(yàn)，重編程的時(shí)間進(jìn)程的確

3、定可以說是研究細(xì)胞重編程過程中相關(guān)機(jī)制的研究基礎(chǔ)之一，而構(gòu)建高效可控的雙因子慢病毒表達(dá)載體則是研究重編程進(jìn)程的基礎(chǔ)，所以四環(huán)素控制的Hnf1β和Foxa3表達(dá)載體的構(gòu)建對(duì)本課題研究的開展十分重要。
　　細(xì)胞重編程過程與胚胎發(fā)育和細(xì)胞分化過程有一個(gè)共同點(diǎn)是細(xì)胞都經(jīng)歷原有細(xì)胞表觀標(biāo)記的去除和新的細(xì)胞特異的表觀修飾的建立，其中DNA甲基化與DNA去甲基化導(dǎo)致的細(xì)胞DNA甲基化模式的改變被認(rèn)為是其中具有重要調(diào)控作用的機(jī)制。近年來多項(xiàng)研究證

4、明Tet家族(Tet1、Tet2、Tet3)可以催化5-甲基胞嘧啶(5-mC)轉(zhuǎn)化為5-羥甲基胞嘧啶（5-hmC），從而實(shí)現(xiàn)DNA的主動(dòng)去甲基化，而大量研究證明，Tet1在體細(xì)胞重編程中具有十分重要的作用。本課題著重于Tet家族成員在MEF細(xì)胞重編程為iHepSCs中的作用開展了初步研究。
　　我們首先構(gòu)建了四環(huán)素誘導(dǎo)型的Hnf1β和Foxa3轉(zhuǎn)錄因子慢病毒表達(dá)載體，感染小鼠成纖維細(xì)胞后利用多西環(huán)素(doxycycline，Dox

5、)來控制外源雙因子的表達(dá)并觀察細(xì)胞重編程的過程。我們利用這兩個(gè)表達(dá)報(bào)告基因EGFP和mCherry的表達(dá)載體成功獲得了轉(zhuǎn)分化的細(xì)胞克隆，通過鑒定發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后的細(xì)胞在形態(tài)上與iHepSCs相似，在轉(zhuǎn)錄水平上，表達(dá)膽管細(xì)胞的標(biāo)志(CK19)、肝膽共同標(biāo)志(CK18)以及一些肝臟干/前體細(xì)胞標(biāo)志(Dlk1、Sox9、EpCAM)。該結(jié)果證明我們初步建立了四環(huán)素控制的MEF細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為iHepSCs的誘導(dǎo)體系。另外我們還發(fā)現(xiàn)，將獲得的重編程細(xì)胞培

6、養(yǎng)在撤掉Dox的iHepSCs培養(yǎng)液中，細(xì)胞的干性特征在許多方面發(fā)生了變化，提示我們所獲得的細(xì)胞中，外源基因的表達(dá)在其干性維持中起著非常重要的作用。該體系的建立為后續(xù)的研究奠定了基礎(chǔ)。
　　然后，我們利用qRT-PCR和免疫熒光染色方法證明了Tet家族成員在MEF重編程為iHepSCs過程中的表達(dá)激活，同時(shí)也證明了其在iHepSCs細(xì)胞中的表達(dá)維持，這些都提示了Tet家族的重要作用。與其表達(dá)相一致，細(xì)胞中5mC和5hmC的水平也發(fā)

7、生了相應(yīng)的變化。我們將利用Dox誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)對(duì)重編程過程中的細(xì)胞在不同的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取樣，對(duì)這個(gè)過程中Tet表達(dá)水平及細(xì)胞甲基化和羥甲基化水平的變化規(guī)律做深入研究，并揭示該過程中轉(zhuǎn)錄組表達(dá)變化與甲基化水平變化之間的相關(guān)性。
　　總之，本研究中我們建立了四環(huán)素誘導(dǎo)型的Hnf1β和Foxa3轉(zhuǎn)錄因子慢病毒表達(dá)載體并成功地建立了轉(zhuǎn)分化的誘導(dǎo)體系，獲得了由MEF細(xì)胞轉(zhuǎn)分化而來的誘導(dǎo)型肝干細(xì)胞，并初步證明了Tet家族在重編程過程和干細(xì)胞干性維