Fos-Jun連接的AFP-HLA-A2二聚體的制備及其構(gòu)象穩(wěn)定性的分析.pdf

1、HLA-A2是一種經(jīng)典的MHC I類(lèi)分子，含兩條多肽鏈：重鏈（H鏈或α鏈,包括α1、α2和α3結(jié)構(gòu)域）與輕鏈（L鏈或β2m鏈），其中β2m非共價(jià)結(jié)合于α3結(jié)構(gòu)域?？乖慕Y(jié)合于由α1、α2形成的抗原結(jié)合槽，當(dāng)抗原肽與MHC分子結(jié)合形成pMHC，可被APC呈遞給CD8+T細(xì)胞表面的TCR識(shí)別，引起特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答。α鏈、β2m鏈和抗原肽三者的穩(wěn)定結(jié)合，對(duì)維持MHCⅠ類(lèi)分子天然構(gòu)象及發(fā)揮生物功能具有重要的意義。因此，我們將抗原肽、α鏈、β2

2、m鏈穩(wěn)定連接，以期獲得不易解離的pMHC復(fù)合物，保證其結(jié)構(gòu)與功能的完整。研究證實(shí)pMHC單體與TCR的親和力較低，不能有效的激活CTL，于是后期研究通過(guò)將pMHC多聚化來(lái)提高抗原與TCR的親和力，并發(fā)現(xiàn)可溶性pMHC二聚體可與TCR高親和力結(jié)合。
　　前期研究表明，非共價(jià)連接的HLA-A2二聚體，具有檢測(cè)與調(diào)節(jié)CTL的功能。由于非共價(jià)連接具有可逆性，不能耐受SPA純化的酸性環(huán)境，故本室曾通過(guò)兩個(gè)柔性連接肽(G4S)3將AFP抗原肽

3、、β2m鏈與α鏈三者共價(jià)連接，并在CHO細(xì)胞中表達(dá)出共價(jià)連接的AFP/HLA-A2二聚體，但是該二聚體經(jīng)SPA純化后，其構(gòu)象仍會(huì)改變而影響生物學(xué)活性。故本課題靈活采用共價(jià)與非共價(jià)連接方式，首先將AFP抗原肽通過(guò)(G4S)3共價(jià)連接至β2m鏈，再通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子Fos和Jun形成的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)將AFP-(G4S)3-β2m鏈以疏水結(jié)合作用非共價(jià)連接至α鏈，使抗原肽穩(wěn)定加載至融合的HLA-A2/IgG1-Fc單體上，兩個(gè)pMHC單體借助Fc段

4、的鏈間二硫鍵連接形成Fos-Jun連接的AFP/HLA-A2二聚體，以便后續(xù)可經(jīng)SPA純化得到純度較高的正確構(gòu)象二聚體，旨在提高pMHC二聚體與TCR的親和力，從而高效擴(kuò)增pMHC特異性的同種反應(yīng)性T細(xì)胞。本研究主要內(nèi)容與結(jié)果如下：
　　一、Fos-Jun連接的AFP/HLA-A2二聚體的制備
　　為了構(gòu)建pFastBacTMDual＋［AFP-(G4S)3-β2m-Jun］+［HLA-A2-Fos/IgG1-Fc］表達(dá)質(zhì)粒

5、，選用本室保存的具有P10和Ph兩個(gè)啟動(dòng)子的pFastBacTMDual空質(zhì)粒為載體，將擴(kuò)增所獲的基因片段分別插入該載體兩側(cè)啟動(dòng)子下游。以本室前期構(gòu)建的質(zhì)粒pFastBacTMDual+［DR15/IgG1-Fc］為模板，分別擴(kuò)增出轉(zhuǎn)錄因子Fos和Jun序列以及IgG1-Fc基因；以Invitrogen公司合成的pMD19-T+AFP-(G4S)3-β2m質(zhì)粒作為模板，擴(kuò)增出AFP-(G4S)3-β2m基因片段；應(yīng)用人HLA-A2特異性

6、引物從T2細(xì)胞中擴(kuò)增HLA-A2(α1-α3)。再通過(guò)重疊PCR方法，分別將AFP-(G4S)3-β2m與Jun和HLA-A2與Fos基因片段連接。最后通過(guò)酶切位點(diǎn)將AFP-(G4S)3-β2m-Jun融合基因插入P10啟動(dòng)子下游，將HLA-A2-Fos、IgG1-Fc融合基因依次插入Ph啟動(dòng)子下游，獲得目的質(zhì)粒pFastBacTMDual＋［AFP-(G4S)3-β2m-Jun］+［HLA-A2-Fos/IgG1-Fc］。經(jīng)過(guò)特異性引

7、物對(duì)各基因片段的PCR鑒定、限制性?xún)?nèi)切酶的酶切鑒定和堿基序列測(cè)定均證實(shí)目的基因按照正確的順序完全插入了質(zhì)粒。
　　pFastBacTMDual＋［AFP-(G4S)3-β2m-Jun］+［HLA-A2-Fos/IgG1-Fc］重組質(zhì)粒在大腸桿菌 DH10BacTM輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)座酶的作用下，轉(zhuǎn)化入桿狀病毒穿梭質(zhì)粒，形成Bacmid+［AFP-(G4S)3-β2m-Jun］+［HLA-A2-Fos/IgG1-Fc］,將 PCR鑒定正確的

8、重組Bacmid DNA轉(zhuǎn)染至昆蟲(chóng)細(xì)胞SF9中，在轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞上清中即可表達(dá)Fos-Jun連接的AFP/HLA-A2二聚體。收獲此上清，其中含成熟病毒顆粒，繼續(xù)感染正常SF9細(xì)胞，用構(gòu)像依賴(lài)性抗體W6/32進(jìn)行ELISA檢測(cè)每一代上清中Fos-Jun連接的AFP/HLA-A2二聚體的構(gòu)象與分泌水平，結(jié)果證實(shí)獲得了正確構(gòu)像的融合蛋白，且感染后第五代的SF9上清中Fos-Jun連接的AFP/HLA-A2二聚體表達(dá)量最高。大量收集感染第五代

9、病毒的SF9上清，通過(guò)Western-Blot鑒定由Fos-Jun連接的AFP/HLA-A2單體的分子量約77KD，與預(yù)期相符。最后通過(guò) FITC-BB7.2抗體流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，結(jié)果示 Fos-Jun連接的AFP/HLA-A2二聚體與HLA-A2陰性個(gè)體的單核細(xì)胞有一定的結(jié)合率。
　　二、Fos-Jun連接的AFP/HLA-A2二聚體與共價(jià)連接的AFP/HLA-A2二聚體的構(gòu)象穩(wěn)定性分析
　　雖然Fos-Jun連接的AFP/

10、HLA-A2二聚體與共價(jià)連接的AFP/HLA-A2二聚體都含有IgG1-Fc片段，理論上都可用金黃色葡萄球菌蛋白A（SPA）進(jìn)行純化。但前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)共價(jià)連接的AFP/HLA-A2二聚體在洗脫液（pH3.0的0.1M甘氨酸）的酸性環(huán)境中易發(fā)生β2m脫落，破壞其完整結(jié)構(gòu)。為了解決SPA純化導(dǎo)致構(gòu)象嚴(yán)重丟失的問(wèn)題，本試驗(yàn)采用不易受pH等環(huán)境影響的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)將AFP-(G4S)3-β2m和α鏈連接，并通過(guò)BEVS表達(dá)出Fos-Jun連接的A

11、FP/HLA-A2二聚體。將Fos-Jun連接的AFP/HLA-A2二聚體與共價(jià)連接的AFP/HLA-A2二聚體經(jīng)SPA純化后的構(gòu)象變化做對(duì)比，發(fā)現(xiàn)大部分共價(jià)連接的AFP/HLA-A2二聚體中β2m脫落，導(dǎo)致該二聚體構(gòu)象缺失（構(gòu)象完整率：12.3％±3.26%，n=3）；而大部分Fos-Jun連接的AFP/HLA-A2二聚體卻可保持構(gòu)像的完整（構(gòu)象完整率：71.24%±12.1%,n=3）。說(shuō)明在酸性環(huán)境中，F(xiàn)os-Jun形成的亮氨酸拉