共價連接AFP-β2m-HLA-A2-IgG1Fc二聚體的制備.pdf

1、表達在細胞膜上的MHC I類分子由三分子組成，MHCI類的重鏈（H鏈）、輕鏈（L鏈，即β2m）和抗原肽（antigenic peptide），形成抗原肽/MHC復(fù)合物（pMHC），其基本生物學(xué)功能是提呈抗原給CD8+T細胞表面的TCR識別。作為TCR的配體，pMHC多聚體已廣泛應(yīng)用于抗原特異性T細胞的檢測及功能調(diào)控，其常見的形式為二聚體、四聚體、五聚體。pMHC二聚體是通過制備MHC與抗體Fc段的融合蛋白，通過Fc段鉸鏈區(qū)的二硫健將兩個

2、MHC分子連接起來，再將MHC限制性抗原肽結(jié)合到MHC-Ig二聚體的抗原肽結(jié)合槽上,形成的pMHC二聚體能夠與T細胞表面TCR更穩(wěn)定的結(jié)合,可以體外誘導(dǎo)或抑制抗原特異性CTL的應(yīng)答。
　　本實驗室已構(gòu)建不同的pMHC二聚體，尤其以HLA-A2二聚體為主，前期工作已證實可溶性HLA-A2/IgG1Fc二聚體在體外可以抑制同種反應(yīng)性T細胞的應(yīng)答。然而該二聚體的抗原肽、β2m和HLA-A2分子重鏈三者之間是非共價連接的，在體內(nèi)環(huán)境下，這

3、三者極易解離并被降解，不利于抗原特異性T細胞的制備和擴增。為了解決這個問題，我們將抗原肽、β2m和HLA-A2分子重鏈三者之間通過共價連接，組成共價連接的HLA-A2二聚體，其結(jié)構(gòu)在體內(nèi)更穩(wěn)定，是腫瘤特異性T記憶性干細胞體內(nèi)研究的有利工具。
　　在本實驗室已構(gòu)建β2m共價連接的HLA-A2/IgG1Fc二聚體表達載體的基礎(chǔ)上，本課題將抗原肽（HLA-A2限制性甲胎蛋白抗原肽，hAFP158-166）和β2m基因通過共價連接重組到

4、HLA-A2/IgG1Fc基因片段中，表達共價連接AFP-β2m-HLA-A2/IgG1Fc二聚體，并鑒定其構(gòu)象功能的正確性。
　　目的：制備共價連接的AFP-β2m-HLA-A2/IgG1Fc二聚體。
　　方法：1）pcDNA3.1+[AFP-β2m-HLA-A2/IgG1Fc]真核表達載體的構(gòu)建；通過雙酶切獲取AFP-β2m基因和pcDNA3.1+[HLA-A2/IgG1Fc]載體，將AFP-β2m基因插入pcDNA3.

5、1+[HLA-A2/IgG1Fc]載體中重組形成pcDNA3.1+[AFP-β2m-HLA-A2/IgG1Fc]真核表達載體；2）重組pcDNA3.1+[AFP-β2m-HLA-A2/IgG1Fc]載體轉(zhuǎn)染中國倉鼠卵巢細胞CHO后表達共價連接AFP-β2m-HLA-A2/IgG1Fc二聚體，利用MHC I類分子構(gòu)象依賴性抗體W6/32和抗人β2m抗體ELISA法檢測其構(gòu)象，通過抗人IgG1Fc抗體Western-Blot檢測融合蛋白的分

6、子量，HLA-A2構(gòu)象性抗體BB7.2流式檢測其IgG1Fc段的結(jié)合功能。
　　結(jié)果：菌液PCR、酶切鑒定均顯示融合基因片段與預(yù)期值相符，基因測序比對結(jié)果與理論設(shè)計的基因序列完全吻合，表明成功構(gòu)建了pcDNA3.1+[AFP-β2m-HLA-A2/IgG1Fc]真核表達載體；將該表達載體轉(zhuǎn)染中國倉鼠卵巢細胞CHO，經(jīng)400ug/ml的G418篩選獲得穩(wěn)定表達的細胞株，ELISA法測定其細胞上清中共價連接AFP-β2m-HLA-A2