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文檔簡介
1、大黃魚(Pseudosciana crocea(Richardson,1846))作為我國四大重要海洋經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚類之一,正面臨著巨大的病害困惱,使得其養(yǎng)殖效益受到前所未有的挑戰(zhàn)。屬于低等脊椎動物的大黃魚,其獲得性免疫系統(tǒng)相對于高等哺乳動物而言還處于進(jìn)化上的不完善狀態(tài):而其天然免疫系統(tǒng)相對發(fā)達(dá),能夠有效的防御病原的入侵。為此,我們分析Hepcidin基因,其是一種天然短肽分子,為天然免疫中重要的非特異性免疫分子。本文著重研究大黃魚Hepc
2、idin基因的多樣性、啟動子特征以及抗菌分析,為大黃魚病害防治提供理論和技術(shù)支持。
通過對大黃魚poly(I:C)誘導(dǎo)的脾臟組織cDNA文庫測序發(fā)現(xiàn)多條Hepcidins基因的cDNAs序列。為了進(jìn)一步分析不同類型的Hepcidin基因在魚的各個組織如脾臟、腎臟、肝臟、血、肌肉以及腸中表達(dá)水平差異,依據(jù)Hepcidin一致序列設(shè)計引物,對每一個組織進(jìn)行PCR擴(kuò)增并將擴(kuò)增產(chǎn)物(Hepcidin基因庫)克隆到T載體;挑取所有的
3、陽性克隆測序并發(fā)現(xiàn)Hepcidin基因存在更多的類型。序列比對發(fā)現(xiàn)所有的Hepcidin基因可以分為7類,分別為C1-C7(cDNA序列)/PR1-PR7(氨基酸序列)。C6較其它類型Hepcidin序列差最大,存在與鐵離子結(jié)合相關(guān)序列;剩下幾類序列相似性較高。各種類型的Hepcidin基因在組織中mRNA的表達(dá)水平定義為單一類型的Hepcidin克隆數(shù)占總的Hepcidin基因克隆數(shù)的比值(%)(第六類除外);發(fā)現(xiàn)C1和C4類Hepc
4、idin基因的mRNA在各種組織中組成型的高水平表達(dá),C7組成型的低水平表達(dá),其它類型Hepcidin基因的mRNA則特異性的低水平的表達(dá)于幾個組織中。軟件分析氨基酸序列包含有三個結(jié)構(gòu)域:分別為信號肽(Signal peptide)(Residues1-25),前導(dǎo)肽(Prodomain),(Residues26-59)以及成熟肽(Mature peptide)(Residues60-85)。為了了解Hepcidin基因組DNA序列的多
5、樣性,依據(jù)Hepcidin cDNA的共有序列設(shè)計引物,PCR擴(kuò)增出其基因組DNA序列并挑取12個陽性克隆進(jìn)行測序;結(jié)果表明這12個克隆子序列可以歸為6類Hepcidin基因組DNA序列,分別稱為G1-G6。根據(jù)DNA序列一致性比對發(fā)現(xiàn),G1-G6分別與cDNA的C1-C6存在一一對應(yīng)關(guān)系;第7類_Hepcidin cDNA對應(yīng)的基因組DNA序列未克隆到。6個Hepcidins基因結(jié)構(gòu)都是由3個外顯子和2個內(nèi)含子構(gòu)成且存在三個突變熱點(diǎn)區(qū)
6、域分別是第一個內(nèi)含子、第二個內(nèi)含子以及第三個外顯子;Hepcidin的第一個內(nèi)含子和第二個內(nèi)含子都存在規(guī)律性的小片段堿基缺失。以上研究表明Hepcidin基因的cDNA可能由多個基因編碼。
為了進(jìn)一步探討以上各類Hepcidins調(diào)控區(qū)是否存在序列和調(diào)控的多樣性,通過genome walker技術(shù)克隆到6個與Hepcidin基因的各類cDNA相對應(yīng)的5'端調(diào)控序列;這6個5'端調(diào)控序列差異較大,并分別命名為Pro1、Pro
7、2、Pro3、Pro4、Pro5和Pro6。報告基因分析顯示Pro1、Pro2、Pro3、Pro4、Pro5和Pro6(刪除突變子PF2)都具有強(qiáng)弱不同的啟動子活性。
通過逐一刪除突變和報告基因分析,我們探討各類Hepcidin5'-調(diào)控區(qū)的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄活性位點(diǎn)以及其啟動子特征。研究發(fā)現(xiàn):
位于ATG上游181nt的STAT轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列決定Pro1的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄活性。從整體刪除突變酶活變化分析:存在一個弱的V型走
8、勢并在刪除突變子PF4處達(dá)到V型的底部,說明在PF4處存在負(fù)向調(diào)控序列;在刪除突變子PF3和PF2存在一個活性突降,推測可能存在類似增強(qiáng)子的元件;以上分析也表明Pro1控制的基因C1存在著復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制。
Pro2啟動子的基礎(chǔ)性轉(zhuǎn)錄活性是由位于翻譯起始位點(diǎn)(ATG)上游195 nt的NFkB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)決定。從整體刪除突變酶活變化分析:位于刪除突變子PF2與全長野生型之間以及刪除突變子PF3/4-2和PF3/4-3之間
9、存在兩個顯著的突降,由此認(rèn)為在這幾個刪除突變子之間的序列存在類似增強(qiáng)子功能的元件;這說明Pro2的調(diào)控機(jī)制以及由其所控制的基因C2表達(dá)調(diào)控是非常復(fù)雜的。
Pro3基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄活性是由位于翻譯起始位點(diǎn)(ATG)上游175 nt的STAT轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列決定。從整體刪除突變酶活變化分析:發(fā)現(xiàn)位于刪除突變子PF2和PF5附近存在負(fù)向調(diào)控序列,而距其較遠(yuǎn)處存在抑制這種負(fù)向調(diào)控的結(jié)合位點(diǎn);這說明Pro3的調(diào)控機(jī)制以及由Pro3控制的基因
10、C3調(diào)控機(jī)制是很復(fù)雜的。
Pro4的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄活性由位于翻譯起始位點(diǎn)(ATG)的上游163 nt的E-box決定。另外,Pro4的刪除突變分析呈現(xiàn)出一個V型走勢,即從野生型到刪除突變子PF4其啟動子活性由高到低逐漸降低;但進(jìn)一步刪除后,其活性反而增強(qiáng),表明在突變子PF4的前后序列中存在著負(fù)向調(diào)控因子結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)合C4基因的組織表達(dá)模式,表明Pro4的啟動子及其控制的C4基因受到復(fù)雜的調(diào)控。
Pro5基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄活性
11、由位于翻譯起始位點(diǎn)(ATG)上游440 nt HFH1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列決定。調(diào)控模式相對簡單且其對應(yīng)的基因C5低水平特異的表達(dá)于幾個組織中。Pro6的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄活性位點(diǎn)是位于翻譯起始位點(diǎn)(ATG)上游到刪除突變子PF3之間的序列。盡管由其控制的基因C6在各個組織中都有不同程度的表達(dá)且肝中表達(dá)水平最高,整個5'端調(diào)控區(qū)卻沒有活性;總之,Hepcidin各類基因的5'端調(diào)控區(qū)都存在復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制,特別是基因C1-C4,暗示其生理功能的重要性。
12、
不同濃度的LPS和poly(I:C)對Hepcidin5'端調(diào)控區(qū)啟動子活性誘導(dǎo)分析,結(jié)果顯示:Pro-4在LPS的濃度為6μg/ml時,其啟動子活性為未刺激的5倍;Pro3在LPS的濃度為2μg/ml其活性為未刺激的2.5倍;Pro2對LPS刺激響應(yīng)最大濃度為8μg/ml,其活性為對照的2.5倍;而LPS不能誘導(dǎo)Prol、Pro5和Pro6的啟動子活性上調(diào)。不同濃度的poly(I:C)刺激,hepcidin啟動子活性除
13、了Pro4出現(xiàn)顯著上調(diào)外(濃度為50μg/ml增加1.5倍),其它幾個啟動子活性均未出現(xiàn)顯著的上調(diào)。
通過對人工合成Hepcidin成熟肽最低抑制濃度(MIC)的分析發(fā)現(xiàn),不同Hepcidin基因的成熟肽其抗菌譜存在顯著差異;然而這些Hepcidin成熟肽都存在8個保守的半胱酸殘基,表明其它氨基酸的突變也可以改變其抗菌活性。
此外,我們也克隆了TLR22和管家基因β-actin。TLR22是天然免疫受體分子,
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