Wnt2b對肝纖維化進程影響及機制研究.pdf

1、研究目的：
　　1.觀察Wnt2b在臨床纖維化相關(guān)肝病患者及肝纖維化模型小鼠肝組織中的表達水平變化，鑒定Wnt2b的主要細胞來源;
　　2.分析肝內(nèi)Wnt2b表達水平對肝纖維化疾病進程及HSCs活化程度的影響;
　　3.闡明Wnt2b調(diào)控纖維化進程及HSCs活化的分子機制。
　　研究方法：
　　1.應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法對臨床纖維化相關(guān)肝病患者及健康對照肝組織芯片中Wnt2b的表達情況進行檢測;
　　2

2、.分別應(yīng)用硫代乙酰胺(TAA)、四氯化碳(CCl4)腹腔注射法建立小鼠肝纖維化模型;
　　3.應(yīng)用體外CCl4飽和溶液刺激法建立體外肝實質(zhì)細胞受損模型;
　　4.應(yīng)用免疫組織化學(xué)法、Western blotting及PCR法檢測肝組織中Wnt2b蛋白與基因水平;
　　5.應(yīng)用ELISA法檢測小鼠肝組織勻漿中Wnt2b表達水平;
　　6.應(yīng)用冰凍切片免疫熒光雙染法檢測Wnt2b在小鼠肝組織中的表達與定位;
　

3、　7.應(yīng)用肝臟原位灌流及密度梯度法分離并比較Wnt2b在小鼠肝實質(zhì)細胞及非肝實質(zhì)細胞中表達水平;
　　8.應(yīng)用肝臟原位灌流及密度梯度法分離鑒定小鼠HSCs，檢測Wnt2b在纖維化小鼠HSCs中的表達水平;
　　9.分離野生型C57BL/6小鼠原代HSCs，檢測體外培養(yǎng)自活化過程中Wnt2b表達水平;
　　10.通過尾靜脈高壓注射的方式，將Wnt2b沉默/過表達質(zhì)粒導(dǎo)入肝臟，Western blotting檢測肝組織中W

4、nt2b蛋白水平以評價所用質(zhì)粒效率;
　　11.將TAA造模小鼠隨機分為四組，即sh-對照載體組與Sh-Wnt2b組，Over-對照載體組與Over-Wnt2b組，評價沉默/過表達肝內(nèi)Wnt2b水平對纖維化進程影響:應(yīng)用H&E、天狼猩紅染色法、Western blotting、免疫熒光法、流式細胞術(shù)、ALT法等檢測干預(yù)肝內(nèi)Wnt2b水平對TAA造模小鼠肝臟膠原沉積、HSCs活化、炎性細胞浸潤及肝細胞損傷程度的影響，以評價沉默/過表

5、達肝內(nèi)Wnt2b水平對纖維化進程的可能調(diào)控作用。
　　12.肝臟原位灌流及Opti-Prep密度梯度離心分離野生型C57BL/6小鼠HSCs，體外培養(yǎng)1天（靜息期）及14天（活化期），提取RNA，應(yīng)用PCR法檢測HSCs Wnt相關(guān)受體表達情況，并比較靜息期與活化期受體水平變化;
　　13.采取Wnt2b條件培養(yǎng)基孵育HSCs及瞬時轉(zhuǎn)染W(wǎng)nt2b過表達質(zhì)粒兩種方式，模擬纖維化進程中旁分泌/HSCs自分泌來源的Wnt2b，并應(yīng)

6、用PCR及Westernblotting法檢測Wnt2b對HSCs中α-SMA、Ⅰ型膠原基因及蛋白水平影響;
　　14.應(yīng)用免疫組織化學(xué)法、PCR及Western blotting法檢測肝組織中β-Catenin蛋白與基因水平;
　　15.應(yīng)用肝臟原位灌流及密度梯度法分離小鼠HSCs，檢測纖維化小鼠HSCs中β-Catenin的表達水平.
　　研究結(jié)果：
　　1.Wnt2b在人及小鼠纖維化肝臟中表達升高
　

7、　與健康對照組相比，臨床纖維化相關(guān)肝病患者肝組織中Wnt2b表達水平顯著升高。與臨床樣本檢測結(jié)果一致，TAA及CCl4兩種纖維化模型誘導(dǎo)小鼠肝組織中均呈現(xiàn)Wnt2b表達水平升高現(xiàn)象。這一現(xiàn)象提示，Wnt2b可能參與調(diào)控肝纖維化疾病進程。
　　2.肝實質(zhì)細胞是纖維化肝臟中表達Wnt2b的主要來源
　　免疫熒光雙染法結(jié)果提示，Wnt2b主要定位在小鼠肝實質(zhì)細胞上。肝臟原位灌流法分離小鼠肝實質(zhì)細胞及非肝實質(zhì)細胞，結(jié)果顯示，在纖維化

8、小鼠肝實質(zhì)細胞中Wnt2b蛋白及基因水平均呈現(xiàn)明顯升高趨勢，而在非肝實質(zhì)細胞中Wnt2b略有上調(diào);體外實驗亦證明，當原代肝實質(zhì)細胞受到化學(xué)毒物刺激時，其Wnt2b基因及蛋白水平均可發(fā)生明顯上調(diào)。肝臟原位灌流法分離小鼠HSCs，結(jié)果顯示，從纖維化肝臟分離的HSCs其Wnt2b表達水平高于正常對照組;而體外結(jié)果證明在HSCs自活化過程中亦伴隨著Wnt2b表達水平升高現(xiàn)象，提示作為非肝實質(zhì)細胞中的重要組成部分，活化型HSCs也可一定程度上調(diào)W

9、nt2b，但其對于纖維化肝內(nèi)Wnt2b總體水平貢獻程度低于肝實質(zhì)細胞。以上結(jié)果表明，肝實質(zhì)細胞是纖維化肝臟中表達Wnt2b的主要來源。
　　3.Wnt2b具有抗纖維化發(fā)展作用
　　通過尾靜脈高壓注射的方式，將Wnt2b沉默/過表達質(zhì)粒導(dǎo)入纖維化造模小鼠肝臟，Western blotting結(jié)果顯示，與對照組相比，注射Wnt2b沉默質(zhì)粒組小鼠肝組織Wnt2b水平降低，而注射Wnt2b過表達質(zhì)粒組小鼠肝組織Wnt2b蛋白水平升高

10、，提示所用質(zhì)粒有效性，可以用于干預(yù)TAA造模小鼠肝內(nèi)Wnt2b水平，以評價Wnt2b對纖維化進程影響。結(jié)果顯示，降低肝內(nèi)Wnt2b水平將明顯促進纖維化肝臟膠原沉積、HSCs活化及炎性細胞浸潤，即加劇纖維化疾病進程;而升高肝內(nèi)Wnt2b水平可抑制纖維化肝組織內(nèi)膠原沉積、HSCs活化及炎性細胞浸潤，說明Wnt2b具有抗纖維化發(fā)展的作用。
　　4.Wnt2b抑制體外HSCs活化
　　分離野生型C57BL/6小鼠原代HSCs，RT-

11、PCR結(jié)果顯示HSCs表達多種Wnt家族相關(guān)受體;比較靜息期及活化期HSCs受體水平發(fā)現(xiàn)，活化型HSCs中Fzd4與Fzd7受體基因水平上調(diào)，提示W(wǎng)nt2b對HSCs可能存在直接調(diào)控作用。進一步體外實驗結(jié)果證實，Wnt2b條件培養(yǎng)基及瞬時轉(zhuǎn)染W(wǎng)nt2b過表達質(zhì)粒均可顯著抑制HSCs中α-SMA及Ⅰ型膠原基因與蛋白水平，提示旁分泌和/或自分泌來源的Wnt2b對HSCs活化存在負向調(diào)節(jié)作用。
　　5.β-catenin在肝纖維化過程中

12、上調(diào)
　　與對照組相比，TAA造模組小鼠肝臟中β-Catenin基因及蛋白水平均呈現(xiàn)明顯上調(diào)趨勢。肝臟原位灌流法分離小鼠HSCs，結(jié)果顯示，從纖維化肝臟分離的HSCs其β-Catenin表達水平高于對照組，且伴有入核增多現(xiàn)象;體外實驗亦證明，在HSCs自活化過程中伴隨著β-Catenin表達水平升高及核轉(zhuǎn)位增多現(xiàn)象。
　　6.Wnt2b可直接上調(diào)β-Catenin表達
　　與對照組相比，尾靜脈高壓注射Wnt2b過表達質(zhì)

13、粒組小鼠肝臟中β-Catenin表達水平明顯上調(diào)，提示W(wǎng)nt2b可促進β-Catenin表達。體外實驗中，Wnt2b條件培養(yǎng)基及瞬時轉(zhuǎn)染W(wǎng)nt2b過表達質(zhì)粒均可顯著上調(diào)HSCs中β-Catenin表達，提示旁分泌和/或自分泌來源的Wnt2b對HSCs中β-Catenin存在直接調(diào)控作用。
　　7.Wnt2b抑制HSCs活化不依賴于β-Catenin經(jīng)典通路
　　應(yīng)用β-catenin干擾質(zhì)粒發(fā)現(xiàn)，沉默β-catenin并未削

14、弱Wnt2b對LX2細胞α-SMA及Ⅰ型膠原的抑制作用，提示W(wǎng)nt2b雖然可促進β-catenin表達及活化，但這并非是其發(fā)揮抗纖維化效應(yīng)的關(guān)鍵機制，提示W(wǎng)nt2b可能循其它通路調(diào)控HSCs活化及纖維化進程。
　　8.TLR4在肝纖維化過程中上調(diào)
　　與對照組相比，TAA造模組小鼠肝臟中TLR4基因及蛋白水平呈現(xiàn)明顯上調(diào)趨勢。肝臟原位灌流法分離小鼠HSCs，結(jié)果顯示，從纖維化肝臟分離的HSCs其TLR4表達水平高于對照組。同

15、時可觀察到小腸細菌過度生長及菌群移位現(xiàn)象，提示TLR4通路與纖維化疾病進程的相關(guān)性。
　　研究結(jié)論：
　　1.本研究發(fā)現(xiàn)，Wnt2b在人及小鼠纖維化肝臟中表達升高，肝實質(zhì)細胞是纖維化肝臟中表達Wnt2b的主要來源，活化后HSCs亦可一定程度上調(diào)Wnt2b表達;并且證實Wnt2b可以旁分泌和/或自分泌的形式抑制HSCs活化，發(fā)揮抗纖維化發(fā)展的作用;
　　2.雖然β-Catenin在肝纖維化過程中表達和活化增加，且證實Wn

16、t2b可直接促進β-catenin表達，但是沉默β-Catenin并不影響Wnt2b的抗纖維化效應(yīng)，證明Wnt2b不是通過經(jīng)典β-Catenin通路發(fā)揮抗HSCs活化及纖維化進程作用;
　　3.本研究闡明，Wnt2b對于HSCs中TLR4通路存在負向調(diào)控作用，抑制TLR4通路信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及靶分子表達;Wnt2b可以抑制TLR4通路對HSCs的直接促活化效應(yīng)，同時抑制TLR4通路增強HSCs對TGF-β敏感性的作用，從而抑制TLR4通路