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文檔簡(jiǎn)介
1、背景:缺血性心臟病(IHD)是由于冠狀動(dòng)脈循環(huán)改變引起冠脈血流和心肌需求之間不平衡而導(dǎo)致的心肌損害,其病理改變是缺血區(qū)心肌細(xì)胞因缺血缺氧而壞死,梗死區(qū)逐漸被纖維疤痕所替代,殘余心肌則代償性肥厚,發(fā)生心室重構(gòu),而心室重構(gòu)正是造成心梗患者頑固性心力衰竭和死亡的主要原因,雖然藥物及介入等治療手段發(fā)展日新月異,但目前仍無(wú)法從根本上逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)及后續(xù)的心力衰竭。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)可促使心肌細(xì)胞分裂及再生,修復(fù)病變的心肌組織,并維持心臟
2、的自穩(wěn)態(tài),改善心臟功能,BMSCs移植已作為治療心衰的一種手段。近年來(lái)大量研究發(fā)現(xiàn):BMSCs在心肌組織修復(fù)過(guò)程中存在遷移。反應(yīng)性BMSCs是如何遷移到病變心肌組織的,目前已有大量研究表明趨化因子及蛋白磷酸激酶參與BMSCs的遷移,而蛋白磷酸酶對(duì)BMSCs的遷移作用方面的研究報(bào)道尚少。
目的:研究蛋白磷酸酶2A(PP2A)對(duì)本底水平及SDF-1/CXCR4軸介導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)遷移的調(diào)控;探尋SDF-1/CXC
3、R4軸介導(dǎo)的BMSCs遷移過(guò)程中可能發(fā)揮作用的PP2A功能性調(diào)節(jié)亞基。
方法:本實(shí)驗(yàn)以體外培養(yǎng)的SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)為研究模型,采用PP2A的特異性抑制劑,并結(jié)合脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)導(dǎo)入siRNA,從不同的角度調(diào)節(jié)PP2A的活性,并采用劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell遷移小室實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)PP2A對(duì)BMSCs遷移的調(diào)控作用。(1)劃痕實(shí)驗(yàn)(wound-healing):分別用12孔板培養(yǎng)不同處理的各組細(xì)胞,每孔接種細(xì)胞數(shù)控制
4、為1.0×105/ml,進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn),在顯微鏡下觀察劃痕修復(fù)的過(guò)程,比較不同處理組細(xì)胞水平運(yùn)動(dòng)能力的差異。(2)Transwell小室體外遷移實(shí)驗(yàn):取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的BMSCs細(xì)胞培養(yǎng)48h后,消化并收獲細(xì)胞,用無(wú)血清DMEM低糖培養(yǎng)基洗3次,分別接種2.0×105個(gè)細(xì)胞于已行各組處理因素浸潤(rùn)的Transwell小室中(濾膜微孔直徑8μm),行遷移實(shí)驗(yàn)。遷移4h后剪下濾膜,用DAPI熒光染液染色,在20倍熒光顯微鏡下,每孔計(jì)數(shù)5個(gè)視野的細(xì)
5、胞數(shù),并取平均值,比較不同處理因素下BMSCs垂直運(yùn)動(dòng)能力的差異。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的BMSCs分別進(jìn)行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染siNC和siPPP2Ca,前者為對(duì)照組,后者沉默PP2A催化亞基PPP2Ca,采用Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn),通過(guò)與對(duì)照組的比較,評(píng)價(jià)沉默PPP2Ca后BMSCs遷移能力的變化。通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)SDF-1刺激后PP2A主要調(diào)節(jié)亞基的表達(dá)變化,探尋SDF-1介導(dǎo)BMSCs遷移過(guò)程中可能起作用的功能性調(diào)節(jié)亞基。
6、 結(jié)果:(1)Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)中,10nM、25nM、50nM三個(gè)OA梯度濃度組遷移細(xì)胞數(shù)均減少,較對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05);BMSCs遷移能力與OA濃度呈負(fù)相關(guān),OA10nM組與OA25nM組遷移到濾膜上的細(xì)胞數(shù)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05),OA50nM組與OA10nM組和OA25nM組均有差異(p<0.05)。SDF-1與OA共刺激組BMSCs的遷移能力較單SDF-1刺激組明顯降低(p<0.05)(2)
7、劃痕實(shí)驗(yàn)中,本底水平BMSCs遷移的距離比較,OA作用下BMSCs的劃痕愈合距離明顯小于對(duì)照組,12h時(shí)間點(diǎn)OA組與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05),24h、48h時(shí)間點(diǎn)較對(duì)照組均有差異(p<0.05)。驗(yàn)證SDF-1/CXCR4軸的趨化作用,引入SDF-1作為遷移的化學(xué)誘導(dǎo)物后,SDF-1和OA共刺激組在12h、24h、48h的劃痕愈合距離較SDF-1組均明顯減少,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)。(3)siPPP2Ca轉(zhuǎn)染后,PPP2
8、Ca表達(dá)降為對(duì)照組的8.88±1.52%(p<0.05)。轉(zhuǎn)染si-PPP2Ca的BMSCs遷移能力較對(duì)照組明顯減弱(p<0.05);引入SDF-1刺激后,轉(zhuǎn)染siPPP2Ca的BMSCs的遷移能力與對(duì)照組相比,遷移能力有明顯減弱(p<0.05)。(4)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)SDF-1刺激后,PP2A調(diào)節(jié)亞基PPP2R2B表達(dá)量上調(diào)為209.37±41.03%;(p<0.05),STRN3表達(dá)量下調(diào)為39.58±10.77。
結(jié)論
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