蛋白磷酸酶2A調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景：缺血性心臟病（IHD）是由于冠狀動(dòng)脈循環(huán)改變引起冠脈血流和心肌需求之間不平衡而導(dǎo)致的心肌損害，其病理改變是缺血區(qū)心肌細(xì)胞因缺血缺氧而壞死，梗死區(qū)逐漸被纖維疤痕所替代，殘余心肌則代償性肥厚，發(fā)生心室重構(gòu)，而心室重構(gòu)正是造成心梗患者頑固性心力衰竭和死亡的主要原因，雖然藥物及介入等治療手段發(fā)展日新月異，但目前仍無(wú)法從根本上逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)及后續(xù)的心力衰竭。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）可促使心肌細(xì)胞分裂及再生，修復(fù)病變的心肌組織，并維持心臟

2、的自穩(wěn)態(tài)，改善心臟功能，BMSCs移植已作為治療心衰的一種手段。近年來(lái)大量研究發(fā)現(xiàn)：BMSCs在心肌組織修復(fù)過(guò)程中存在遷移。反應(yīng)性BMSCs是如何遷移到病變心肌組織的，目前已有大量研究表明趨化因子及蛋白磷酸激酶參與BMSCs的遷移，而蛋白磷酸酶對(duì)BMSCs的遷移作用方面的研究報(bào)道尚少。
　　目的：研究蛋白磷酸酶2A（PP2A）對(duì)本底水平及SDF-1/CXCR4軸介導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）遷移的調(diào)控；探尋SDF-1/CXC

3、R4軸介導(dǎo)的BMSCs遷移過(guò)程中可能發(fā)揮作用的PP2A功能性調(diào)節(jié)亞基。
　　方法：本實(shí)驗(yàn)以體外培養(yǎng)的SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）為研究模型，采用PP2A的特異性抑制劑，并結(jié)合脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)導(dǎo)入siRNA，從不同的角度調(diào)節(jié)PP2A的活性，并采用劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell遷移小室實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)PP2A對(duì)BMSCs遷移的調(diào)控作用。（1）劃痕實(shí)驗(yàn)（wound-healing）：分別用12孔板培養(yǎng)不同處理的各組細(xì)胞，每孔接種細(xì)胞數(shù)控制

4、為1.0×105/ml，進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)，在顯微鏡下觀察劃痕修復(fù)的過(guò)程，比較不同處理組細(xì)胞水平運(yùn)動(dòng)能力的差異。（2）Transwell小室體外遷移實(shí)驗(yàn)：取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的BMSCs細(xì)胞培養(yǎng)48h后，消化并收獲細(xì)胞，用無(wú)血清DMEM低糖培養(yǎng)基洗3次，分別接種2.0×105個(gè)細(xì)胞于已行各組處理因素浸潤(rùn)的Transwell小室中（濾膜微孔直徑8μm），行遷移實(shí)驗(yàn)。遷移4h后剪下濾膜，用DAPI熒光染液染色，在20倍熒光顯微鏡下，每孔計(jì)數(shù)5個(gè)視野的細(xì)

5、胞數(shù)，并取平均值，比較不同處理因素下BMSCs垂直運(yùn)動(dòng)能力的差異。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的BMSCs分別進(jìn)行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染siNC和siPPP2Ca，前者為對(duì)照組，后者沉默PP2A催化亞基PPP2Ca，采用Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)，通過(guò)與對(duì)照組的比較，評(píng)價(jià)沉默PPP2Ca后BMSCs遷移能力的變化。通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)SDF-1刺激后PP2A主要調(diào)節(jié)亞基的表達(dá)變化，探尋SDF-1介導(dǎo)BMSCs遷移過(guò)程中可能起作用的功能性調(diào)節(jié)亞基。
　

6、　結(jié)果：（1）Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)中，10nM、25nM、50nM三個(gè)OA梯度濃度組遷移細(xì)胞數(shù)均減少，較對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p<0.05）；BMSCs遷移能力與OA濃度呈負(fù)相關(guān)，OA10nM組與OA25nM組遷移到濾膜上的細(xì)胞數(shù)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05），OA50nM組與OA10nM組和OA25nM組均有差異（p<0.05）。SDF-1與OA共刺激組BMSCs的遷移能力較單SDF-1刺激組明顯降低（p<0.05）（2）

7、劃痕實(shí)驗(yàn)中，本底水平BMSCs遷移的距離比較，OA作用下BMSCs的劃痕愈合距離明顯小于對(duì)照組，12h時(shí)間點(diǎn)OA組與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p>0.05），24h、48h時(shí)間點(diǎn)較對(duì)照組均有差異（p<0.05）。驗(yàn)證SDF-1/CXCR4軸的趨化作用，引入SDF-1作為遷移的化學(xué)誘導(dǎo)物后，SDF-1和OA共刺激組在12h、24h、48h的劃痕愈合距離較SDF-1組均明顯減少，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p<0.05）。（3）siPPP2Ca轉(zhuǎn)染后，PPP2

8、Ca表達(dá)降為對(duì)照組的8.88±1.52％（p<0.05）。轉(zhuǎn)染si-PPP2Ca的BMSCs遷移能力較對(duì)照組明顯減弱（p<0.05）；引入SDF-1刺激后，轉(zhuǎn)染siPPP2Ca的BMSCs的遷移能力與對(duì)照組相比，遷移能力有明顯減弱（p<0.05）。（4）骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)SDF-1刺激后，PP2A調(diào)節(jié)亞基PPP2R2B表達(dá)量上調(diào)為209.37±41.03%；（p<0.05），STRN3表達(dá)量下調(diào)為39.58±10.77。
　　結(jié)論