宮內(nèi)營養(yǎng)不良及早期GH干預(yù)對大鼠AMPK-α1-SREBP-1c-ACC-1通路的影響及機(jī)制.pdf

1、背景:
　　脂代謝紊亂是成人代謝綜合征發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，小于胎齡兒(SGA)與此密切相關(guān)。因此，尋找SGA患兒脂代謝異常的相關(guān)靶標(biāo)，開展深入研究十分必要。腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)是一種在真核細(xì)胞生物中廣泛存在的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是一個(gè)異源三聚體復(fù)合物，由α，β和γ三個(gè)亞基組成，α亞基又分為α1和α2催化亞基，其在肝臟脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。目前已經(jīng)證實(shí)AMPK-α1的異常表達(dá)參與脂代謝紊亂的發(fā)生。但

2、SGA個(gè)體整個(gè)發(fā)育期肝臟組織AMPK-α1表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律以及其調(diào)控的脂肪酸代謝是否參與SGA大鼠成年期脂代謝紊亂的發(fā)生？尚未見報(bào)道。我們將從AMPK-α1及其調(diào)控的脂肪酸代謝關(guān)鍵靶基因固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(SREBP-1c)、乙酰輔酶A羧化酶-1（ACC-1）探討SGA大鼠成年期出現(xiàn)脂代謝紊亂的可能機(jī)制。此外，表觀遺傳修飾對SGA誘導(dǎo)的各類代謝疾病的發(fā)生起了重要作用，但目前很少有人關(guān)注AMPK-α1基因的表觀遺傳修飾與SG

3、A大鼠肝臟脂代謝的相關(guān)研究。近年來microRNAs（miRNAs）在脂質(zhì)代謝中的作用受到密切關(guān)注，研究報(bào)道m(xù)iR-370通過miR-122間接影響AMPK、SREBP-1c和ACC-1的表達(dá)，從而調(diào)控脂類代謝，但在SGA模型中這兩個(gè)miRNA是否也參與對AMPK-α1、SREBP-1c及ACC-1基因的調(diào)控，有待進(jìn)一步探討。
　　目前，AMPK已經(jīng)成為肝臟脂質(zhì)代謝紊亂治療的重要靶點(diǎn)之一。眾多研究已表明，SGA者早期應(yīng)用生長激素(

4、GH)后的追趕生長可能對各項(xiàng)代謝參數(shù)均有益。外源性GH治療能恢復(fù)肝臟AMPK-α總蛋白及磷酸化水平，發(fā)揮調(diào)脂功能。在SGA群體中，GH能否同樣通過激活A(yù)MPK-α1影響其下游脂肪酸代謝相關(guān)基因從而達(dá)到早期預(yù)防成年期脂代謝紊亂發(fā)生？這將為今后指導(dǎo)臨床SGA患兒GH治療提供理論依據(jù)。
　　第一部分、宮內(nèi)營養(yǎng)不良對大鼠脂代謝AMPK-α1/SREBP-1α/ACC-1通路的影響及機(jī)制
　　目的:
　　動(dòng)態(tài)觀察SGA大鼠從出生

5、至成年期肝臟AMPK-α1/SREBP-1c/ACC-1通路、通路相關(guān)miRNA及組蛋白乙酰化修飾的變化，明確SGA大鼠脂代謝紊亂的分子機(jī)制。
　　方法:
　　采用孕鼠全孕程半饑餓法建立SGA大鼠模型。仔鼠在1天、21天和70天齡時(shí)分別測量體重和身長，留取血清及肝臟組織標(biāo)本。采用酶法檢測血清甘油三酯(TG)水平和肝臟TG含量;Western blot測定肝臟組織AMPK-α1和細(xì)胞核內(nèi)成熟的SREBP-1c(nSREBP-1

6、c)蛋白的表達(dá)水平;real-time RT-PCR測定肝臟組織AMPK-α1、SREBP-1c和ACC-1 mRNA的表達(dá)水平;CHIP-PCR用于分析肝臟組織AMPK-α1基因組蛋白乙?；?采用miRNA芯片技術(shù)和生物信息學(xué)方法對1天齡AGA及SGA大鼠肝臟組織差異miRNAs進(jìn)行分析篩選，并對篩選結(jié)果采用real-time RT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證。
　　結(jié)果:
　　1.體重和身長比較:1天齡時(shí)SGA大鼠體重和身長均顯

7、著低于AGA大鼠(P均＜0.01);生后早期SGA大鼠出現(xiàn)生長追趕，以體重追趕為主，21天齡時(shí)體重與身長均未完全追趕上AGA大鼠（P＜0.05和P＜0.01）;至70天齡時(shí)體重與身長仍顯著低于AGA大鼠(P＜0.05)。
　　2.血清TG水平比較:1天和21天齡時(shí)SGA和AGA大鼠間血清TG水平均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，70天齡時(shí)SGA大鼠血清TG水平明顯高于AGA大鼠（P＜0.05）。
　　3.肝臟TG含量比較:1天和21天齡時(shí)SG

8、A和AGA大鼠間肝臟TG含量均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，70天齡時(shí)SGA大鼠肝臟TG含量顯著高于AGA大鼠（P＜0.05）。
　　4.各基因蛋白水平表達(dá)比較:1天齡時(shí)SGA和AGA大鼠間肝臟組織AMPK-α1和nSREBP-1c蛋白表達(dá)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;21天和70天齡時(shí)SGA大鼠肝臟組織AMPK-α1蛋白的表達(dá)均顯著低于AGA大鼠（P均＜0.05），nSREBP-1c蛋白的表達(dá)均顯著高于AGA大鼠（P均＜0.05）。
　　5.各基因mR

9、NA水平表達(dá)比較:1天齡時(shí)SGA和AGA大鼠間肝臟組織AMPK-α1、SREBP-1c和ACC-1 mRNA的表達(dá)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;21天和70天齡時(shí)SGA大鼠肝臟組織AMPK-α1 mRNA的表達(dá)均顯著低于AGA大鼠（P＜0.05和P＜0.01），SREBP-1c mRNA的表達(dá)均顯著高于AGA大鼠（P均＜0.01），ACC-1mRNA的表達(dá)均顯著高于AGA大鼠（P＜0.05和P＜0.01）。
　　6.AMPK-α1基因組蛋白H3

10、乙?；奖容^:大鼠肝臟組織AMPK-α1基因啟動(dòng)子區(qū)組蛋白H3乙?；奖容^，1天齡時(shí)SGA與AGA大鼠間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，21天和70天齡時(shí)SGA大鼠顯著低于AGA大鼠（P均＜0.01）。
　　7.miRNA差異表達(dá)譜分析:分析1天齡時(shí)AGA和SGA大鼠肝臟組織miRNAs的表達(dá)譜，在SGA組中表達(dá)上調(diào)＞1.3的miRNA有8個(gè)，表達(dá)下調(diào)＜0.75的miRNA有22個(gè)。
　　8.miRNA-370和miRNA-122表達(dá)比較

11、:1天齡時(shí)肝臟組織miR-122的表達(dá)，SGA與AGA大鼠間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;miR-370的表達(dá)，SGA大鼠顯著低于AGA大鼠（P＜0.05），與芯片篩查結(jié)果一致。21天和70天齡時(shí)肝臟組織miR-122的表達(dá)，SGA與AGA大鼠間比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)miR-370的表達(dá)均無法檢測到。
　　結(jié)論:
　　1.母鼠孕期營養(yǎng)不良所致的子代生長遲緩可延續(xù)至生后早期甚至成年期。
　　2.SGA大鼠幼年期和成年期肝臟

12、脂代謝通路AMPK-α1/SREBP-1c/ACC-1發(fā)生改變，這一變化可能與成年期脂代謝紊亂的發(fā)生密切相關(guān)。
　　3.SGA大鼠幼年期和成年期肝臟AMPK-α1基因啟動(dòng)子區(qū)組蛋白H3乙?；矫黠@降低。
　　4.SGA大鼠出生時(shí)miR-370的表達(dá)明顯下降，該miRNA可能參與SGA大鼠胚胎期及新生兒期代謝的調(diào)控。
　　第二部分、早期GH干預(yù)對SGA大鼠脂代謝AMPK-α1/SREBP-1c/ACC-1通路的影響及機(jī)

13、制
　　目的:
　　探究GH干預(yù)能否通過影響組蛋白乙?；揎?，調(diào)節(jié)肝臟AMPK-α1/SREBP-1c/ACC-1通路的表達(dá)，改善SGA大鼠脂代謝紊亂。
　　方法:
　　采用前期建立的SGA大鼠模型，從大鼠21天齡斷奶時(shí)進(jìn)行rhGH(5 mg/kg/day)干預(yù)至35天齡，對照組予等量生理鹽水每日同時(shí)腹腔注射，分組情況如下:SGA+rhGH組、SGA+NS組、AGA+rhGH組、AGA+NS組。測量大鼠體重和身長

14、，留取血清及肝臟組織標(biāo)本。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清胰島素樣生長因子1（IGF-1）水平;采用酶法檢測血清TG水平和肝臟TG含量;Western blot測定肝臟組織AMPK-α1和nSREBP-1c蛋白的表達(dá)水平;Real-time RT-PCR測定肝臟組織AMPK-α1、SREBP-1c和ACC-1 mRNA的表達(dá)水平;CHIP-PCR用于分析肝臟組織AMPK-α1基因組蛋白乙酰化水平;對肝臟組織miRNA-122采用real-ti

15、meRT-PCR檢測。
　　結(jié)果:
　　1.體重和身長比較:干預(yù)后，21至70天齡期間SGA+rhGH體重與身長增長倍數(shù)均略高于AGA+NS組、AGA+rhGH組及SGA+NS組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。成年期（70天齡）大鼠體重與身長，SGA+NS組顯著低于AGA+NS組及SGA+rhGH組（P＜0.01和P＜0.05）;SGA+NGH、AGA+NS組和AGA+rhGH三組間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2.血清IGF-1水平比

16、較:為探究rhGH腹腔注射是否有效應(yīng)，測定了干預(yù)開始前21天齡，干預(yù)結(jié)束時(shí)35天齡及干預(yù)后成年期70天齡時(shí)大鼠血清IGF-1水平。干預(yù)開始前21天齡，血清IGF-1水平，SGA組明顯低于AGA組(P＜0.05)。干預(yù)結(jié)束時(shí)35天齡，血清IGF-1水平，SGA+NS組顯著低于SGA+rhGH組（P＜0.05），AGA+NS組略低于AGA+rhGH組，但差異不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。干預(yù)結(jié)束后成年期70天齡，血清IGF-1水平，各組間

17、無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均＞0.05）。
　　3.血清TG水平比較:干預(yù)后，成年期（70天齡）大鼠血清TG水平，SGA+NS組顯著高于AGA+NS組及SGA+rhGH組（P均＜0.05）;SGA+rhGH、AGA+NS和AGA+rhGH三組間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　4.肝臟TG含量比較:干預(yù)后，成年期（70天齡）大鼠肝臟TG含量，SGA+NS組顯著高于AGA+NS組及SGA+rhGH組（P均＜0.05）;SGA+rhGH、AGA+NS

18、和AGA+rhGH三組間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　5.各基因蛋白水平表達(dá)比較:干預(yù)后，成年期（70天齡）大鼠肝臟組織AMPK-α1蛋白水平的表達(dá)，SGA+NS組顯著低于AGA+NS組及SGA+rhGH組（P均＜0.05）;SGA+rhGH、AGA+NS和AGA+rhGH三組間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。大鼠肝臟組織nSREBP-1c蛋白水平的表達(dá)，SGA+NS組顯著高于AGA+NS組及SGA+rhGH組（P均＜0.05），SGA+rhGH、AGA

19、+NS和AGA+rhGH三組間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　6.各基因mRNA水平表達(dá)比較:干預(yù)后，成年期（70天齡）大鼠肝臟組織AMPK-α1 mRNA水平的表達(dá)，SGA+NS組顯著低于AGA+NS組及SGA+rhGH組（P均＜0.05）;SGA+rhGH、AGA+NS和AGA+rhGH三組間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。大鼠肝臟組織SREBP-1c和ACC-1 mRNA水平的表達(dá)，SGA+NS組均顯著高于AGA+NS組及SGA+rhGH組（P均＜0

20、.05）;SGA+rhGH、AGA+NS和AGA+rhGH三組間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　7.AMPK-α1基因組蛋白H3乙?；降谋磉_(dá)比較:干預(yù)后，成年期(70天齡)大鼠肝臟組織AMPK-α1基因啟動(dòng)子區(qū)組蛋白H3乙酰化水平，SGA+NS組均顯著低于AGA+NS組及SGA+rhGH組（P均＜0.05）;SGA+rhGH組略低于AGA+NS組及AGA+rhGH組，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;AGA+NS組與AGA+rhGH組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。