應(yīng)用CELL-SELEX篩選PANC-1細(xì)胞適配體技術(shù)研究.pdf

1、細(xì)胞適配體篩選可概括為前期準(zhǔn)備、PCR擴(kuò)增、次級(jí)文庫(kù)制備和篩選四個(gè)部分，本文以這四個(gè)內(nèi)容為導(dǎo)向，對(duì)CELL-SELEX技術(shù)篩選細(xì)胞適配體方法學(xué)進(jìn)行了深入研究。
　　本文首次以人胰腺癌細(xì)胞PANC-1為靶細(xì)胞進(jìn)行適配體篩選研究。在對(duì)照細(xì)胞選擇上引入了一種新的對(duì)照細(xì)胞選擇策略，并確定了A549細(xì)胞為對(duì)照細(xì)胞的反向篩選。細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定對(duì)適配體篩選非常重要，本文通過(guò)高傳代頻率的培養(yǎng)策略來(lái)維持細(xì)胞在整個(gè)篩選過(guò)程中狀態(tài)穩(wěn)定。結(jié)合軟件與PCR擴(kuò)增

2、協(xié)同分析，對(duì)引物序列、PCR擴(kuò)增效率和抗干擾性進(jìn)行考察，確定了本文所用引物在細(xì)胞適配體篩選中的適用性。
　　PCR在CELL-SELEX中被廣范用于擴(kuò)增次級(jí)文庫(kù)。隨機(jī)文庫(kù)為模板的PCR難度大，不確定因素多。本文采用多種PCR方法對(duì)隨機(jī)文庫(kù)PCR特點(diǎn)進(jìn)行考察。發(fā)現(xiàn)退火溫度調(diào)節(jié)對(duì)擴(kuò)增效率影響明顯，對(duì)非特異性擴(kuò)增作用較??；隨機(jī)文庫(kù)PCR對(duì)程序循環(huán)數(shù)極其敏感，循環(huán)數(shù)遠(yuǎn)少于常規(guī)PCR，對(duì)擴(kuò)增效率和選擇性影響較大。在次級(jí)文庫(kù)PCR方法優(yōu)化中，

3、總結(jié)出一套具有廣泛適用性的PCR優(yōu)化策略，對(duì)細(xì)胞適配體篩選次級(jí)文庫(kù)PCR具有指導(dǎo)意義。
　　在次級(jí)文庫(kù)制備中，針對(duì)單鏈分離過(guò)程建立了相應(yīng)的監(jiān)控辦法，可對(duì)過(guò)程及時(shí)反饋，并確定待回收樣品。通過(guò)延長(zhǎng)PCR產(chǎn)物與Streptavidin-Agarose孵育時(shí)間，提高了分離柱對(duì)PCR產(chǎn)物的固載效率。借助核酸助沉劑（Acryl carrier），建立了適用于適配體篩選ssDNA乙醇低溫沉淀回收方法，可以選擇性回收目的ssDAN，回收率在80.

4、0％以上。同時(shí)解決了ssDNA脫鹽、PH平衡和ssDNA濃縮的問(wèn)題。并建立了相應(yīng)的定量表征方法。
　　篩選是CELL-SELEX的主要內(nèi)容，本文對(duì)細(xì)胞適配體篩選與篩選強(qiáng)度調(diào)整方法進(jìn)行了研究。確定了5種基本篩選強(qiáng)度調(diào)整方式（細(xì)胞數(shù)量、ssDNA孵育濃度、孵育時(shí)間、孵育搖床轉(zhuǎn)速和孵育后洗滌），發(fā)現(xiàn)5種調(diào)整方式之間的協(xié)同關(guān)系，確定了細(xì)胞量與文庫(kù)孵育濃度在篩選強(qiáng)度調(diào)節(jié)中的基礎(chǔ)地位，以及孵育后洗滌條件中洗滌時(shí)間在洗滌強(qiáng)度中的決定性作用。