鷹嘴豆F-box蛋白基因CarF-boxl和CarF-box2的克隆、表達(dá)分析和亞細(xì)胞定位.pdf

1、F—box蛋白通過在UPP(泛素-蛋白酶體途徑)中特異識(shí)別底物蛋白而參與細(xì)胞周期調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞凋亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生命活動(dòng)。很多研究結(jié)果表明F-box蛋白通過SCF復(fù)合體調(diào)節(jié)多種激素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,如IAA、JA、GA和乙烯的信號(hào)傳導(dǎo),并且與植物對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)有很大的關(guān)系。故其對(duì)植物抗逆性研究有重要意義。鷹嘴豆是世界第三大豆類作物,主要生長(zhǎng)在干旱和半干旱地區(qū)。它具有生育期短,基因組小的特點(diǎn)。經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的進(jìn)化和對(duì)不良環(huán)境的適應(yīng),鷹嘴

2、豆具有了豐富的耐旱、耐低溫和耐鹽堿等抗逆基因,因此具有其自身的優(yōu)勢(shì)來研究植物的抗逆機(jī)制。目前,鷹嘴豆在分子生物學(xué)方面的研究較為少。
　　 本研究從EST庫中挑選到兩個(gè)F—box蛋白基因在干旱脅迫下高效表達(dá),采用RACE技術(shù)克隆其全長(zhǎng),并對(duì)目的基因進(jìn)行了初步的生物信息學(xué)分析和轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)譜分析,旨在為進(jìn)一步揭示鷹嘴豆F-box蛋白在植物的生長(zhǎng)發(fā)育及在逆境信號(hào)傳導(dǎo)中的作用奠定理論基礎(chǔ)。
　　 CarF-boxl基因的開放閱

3、讀框(ORF)長(zhǎng)1093 bp,編碼一條345個(gè)氨基酸殘基的多肽,含有F-box結(jié)構(gòu)域和Kelch結(jié)構(gòu)域。其理論等電點(diǎn)為5.38,分子量為38.37 kDa。CarF-boxl基因不含有內(nèi)含子。熒光定量PCR分析表明,CarF-boxl在鷹嘴豆的根、莖、葉、花、成熟豆和成熟莢中均有表達(dá),在花中表達(dá)極高。在發(fā)芽過程中,CarF-boxl的表達(dá)呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)。半定量RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明:CarF-boxl在葉片中

4、受干旱誘導(dǎo)顯著,在根中受干旱和鹽誘導(dǎo)顯著,且在葉中還受IAA誘導(dǎo),在其它脅迫及激素處理下表達(dá)有不同程度的下調(diào)。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的洋蔥表皮細(xì)胞GFP瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)表明:CarF-boxl基因編碼的蛋白定位于細(xì)胞核內(nèi)。這些結(jié)果表明,CarF-boxl基因可能通過泛素降解途徑直接或間接的參與了植物生長(zhǎng)代謝和非生物脅迫中的各種信號(hào)調(diào)節(jié)。并且其對(duì)植物花器官的發(fā)育或?qū)﹂_花時(shí)間的生物鐘調(diào)節(jié)有一定的作用。
　　 CarF-box2基因的開放閱讀框(OR

5、F)長(zhǎng)1201 bp,編碼一條261個(gè)氨基酸殘基的多肽,含有F-box結(jié)構(gòu)域和LysM結(jié)構(gòu)域。其理論等電點(diǎn)為6.21,分子量為29.13 kDa。CarF-box2基因含有一個(gè)684 bp的內(nèi)含子。熒光定量PCR分析表明,CarF-boxl在鷹嘴豆的根、莖、葉、花、成熟莢和成熟豆中均有表達(dá),在成熟莢中表達(dá)量極低。在發(fā)芽過程中,CarF-boxl的表達(dá)整體呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。半定量RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明:CarF-box