擬南芥F-box基因AtPP2-B11調(diào)節(jié)鹽脅迫抗性的分子機(jī)理.pdf

1、鹽脅迫嚴(yán)重影響植物的生長(zhǎng)、發(fā)育和作物的產(chǎn)量。為了生存，植物進(jìn)化出了多種分子機(jī)制來(lái)保護(hù)自己避免受到傷害，比如SOS途徑，MAPK級(jí)聯(lián)途徑，不同的離子通道以及抗氧化物、分子伴侶和LEA蛋白等滲透保護(hù)物質(zhì)的合成等。
　　F-box蛋白家族成員眾多，功能多樣，普遍存在于真核生物中，在蛋白降解中發(fā)揮重要作用。蛋白降解是調(diào)控細(xì)胞周期、植物生長(zhǎng)發(fā)育以及響應(yīng)環(huán)境信號(hào)的一種重要的翻譯后調(diào)控機(jī)制。大部分蛋白通過(guò)泛素/26S蛋白酶體途徑被降解，這也是真

2、核生物中最主要的一種蛋白水解途徑。泛素/26S蛋白酶體途徑能夠催化底物的泛素化修飾，被泛素標(biāo)記的底物會(huì)被蛋白酶體識(shí)別并降解，泛素分子被釋放，循環(huán)利用。泛素介導(dǎo)的蛋白降解途徑涉及到三種重要的酶，分別是泛素激活酶E1，泛素結(jié)合酶E2和泛素連接酶E3。在這三種酶中，泛素連接酶E3成員最為豐富，它能特異性的識(shí)別被降解的底物。F-box蛋白是SCF型E3連接酶的重要組分，在許多細(xì)胞進(jìn)程，包括激素響應(yīng)、光形態(tài)建成、花發(fā)育、植物衰老和各種環(huán)境信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

3、，都起到重要的調(diào)控作用。目前，F(xiàn)-box蛋白參與非生物脅迫逐漸成了研究熱點(diǎn)。
　　在擬南芥中，我們發(fā)現(xiàn)包含F(xiàn)-box結(jié)構(gòu)域的基因AtPP2-B11在鹽脅迫中起到重要作用，對(duì)其表達(dá)模式和功能進(jìn)行了分析:
　　(1)AtPP2-B11是擬南芥F-box家族成員之一，在擬南芥各組織中具有組成型表達(dá)的特點(diǎn)，在蓮座葉和花中的表達(dá)量相對(duì)較高。qRT-PCR和Western blot的實(shí)驗(yàn)證明，AtPP2-B11的表達(dá)量受鹽脅迫誘導(dǎo)。

4、r>　　(2)將AtPP2-B11基因轉(zhuǎn)入野生型擬南芥進(jìn)行鹽脅迫處理實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)超表達(dá)AtPP2-B11基因明顯增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因擬南芥在幼苗以及成苗生長(zhǎng)階段的鹽脅迫抗性，而RNA干擾技術(shù)獲得表達(dá)量下降的株系對(duì)鹽脅迫更敏感。
　　(3)為了進(jìn)一步研究AtPP2-B11參與鹽脅迫抗性的原因，我們利用iTRAQ技術(shù)對(duì)AtPP2-B11在蛋白水平上調(diào)控的蛋白進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下AtPP2-B11超表達(dá)株系OE11與WT相比有4331個(gè)蛋白發(fā)

5、生了表達(dá)量的改變。其中，很多參與脅迫響應(yīng)的蛋白以及具有抗氧化作用的蛋白在OE11株系中表達(dá)量上調(diào)明顯，暗示著AtPP2-B11可能通過(guò)影響植物的氧化還原狀態(tài)來(lái)影響植物的抗鹽性。
　　(4)通過(guò)對(duì)差異表達(dá)變化上調(diào)2倍以上的蛋白進(jìn)行逐個(gè)分析，我們發(fā)現(xiàn)AtPP2-B11明顯地影響了脅迫響應(yīng)蛋白家族Annexins的表達(dá)，Annexins家族成員具有抗氧化的作用，在非生物脅迫以及氧化脅迫下能夠錨定在細(xì)胞膜上形成Ca2+通道，促進(jìn)第二信使C

6、a2+的內(nèi)流。其中以AnnAt1為例的實(shí)驗(yàn)證明，AtPP2-B11能夠上調(diào)AnnAt1的表達(dá)，從而在鹽脅迫和ROS之間建立聯(lián)系。
　　(5)超表達(dá)AtPP2-B11明顯的降低了轉(zhuǎn)基因擬南芥ROS的積累，外施GSH和DTT能明顯減弱鹽脅迫對(duì)于植物生長(zhǎng)的抑制作用。
　　(6)通過(guò)對(duì)Na+含量的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，AtPP2-B11影響了植物體內(nèi)Na+的穩(wěn)態(tài)，超表達(dá)AtPP2-B11明顯降低了轉(zhuǎn)基因擬南芥的Na+含量。同時(shí)鹽脅迫下AtPP2

7、-B11誘導(dǎo)了NHX1和，OS3表達(dá)量的上升，從而促使Na+向液泡的運(yùn)輸以及Na+的外排，減弱了Na+對(duì)植物細(xì)胞的毒害作用。
　　(7)我們利用酵母雙雜的方法證明AtPP2-B11能夠與SCF復(fù)合體亞基ASK7、ASK18和ASK19發(fā)生互作，即AtPP2-B11能夠形成SCF復(fù)合體發(fā)揮泛素連接酶E3的功能。
　　(8)酵母雙雜和雙分子熒光互補(bǔ)的實(shí)驗(yàn)表明AtPP2-B11能夠與AtLEA14發(fā)生直接的蛋白互作。實(shí)驗(yàn)證明鹽脅迫

8、下AtPP2-B11對(duì)AtLEA14沒(méi)有降解作用，即AtLEA14并不是AtPP2-B11在鹽脅迫下的底物。然而，AtLEA14能夠提高鹽脅迫下AtPP2-B11蛋白的穩(wěn)定性，使AtPP2-B11在鹽脅迫下的功能得以更好的發(fā)揮。
　　(9)AtLEA14在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平均受鹽脅迫誘導(dǎo)，在擬南芥和酵母中超表達(dá)AtLEA14能夠明顯提高轉(zhuǎn)基因擬南芥和酵母的鹽脅迫抗性。同時(shí)，qRT-PCR的實(shí)驗(yàn)表明，AtLEA14提高了鹽脅迫下脅迫響應(yīng)