唑來(lái)膦酸對(duì)破骨細(xì)胞分化中鈣離子振蕩和CaMKII、CaMKIV、NFATc1基因表達(dá)的影響.pdf

1、目的：利用RANKL誘導(dǎo)小鼠白血病單核巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞株構(gòu)建體外破骨細(xì)胞培養(yǎng)體系，研究唑來(lái)膦酸對(duì)體外破骨細(xì)胞分化成熟過(guò)程中鈣離子振蕩和鈣離子下游關(guān)鍵信號(hào)分子CaMKII、CaMKIV、NFATc1基因表達(dá)的影響，從分子水平探討唑來(lái)膦酸對(duì)破骨細(xì)胞分化和骨吸收功能抑制的作用，進(jìn)而進(jìn)一步揭示唑來(lái)膦酸對(duì)破骨細(xì)胞抑制作用的機(jī)理。
　　方法：1建立RAW264.7細(xì)胞體外培養(yǎng)體系，首先探討不同濃度的唑來(lái)膦酸對(duì)細(xì)胞增殖的影響。將細(xì)胞

2、分為7組：A組，為對(duì)照組；B組~G組，分別用1×10-7mol/L、1×10-6mol/L、5×10-6mol/L、1×10-5mol/L、5×10-5mol/L和1×10-4mol/L濃度的唑來(lái)膦酸處理細(xì)胞。除A組外，其他各組用ZOL作用5d，然后應(yīng)用倒置相差顯微鏡對(duì)細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察，并應(yīng)用噻唑藍(lán)（MTT）實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞增殖情況。2將RAW264.7細(xì)胞分為對(duì)照組和唑來(lái)膦酸（ZOL）處理組，以探討唑來(lái)膦酸對(duì)破骨細(xì)胞生成、

3、Ca2+振蕩、CaMKII、CaMKIV、NFATc1基因表達(dá)的影響。兩組細(xì)胞均用RANKL誘導(dǎo)5d，而 ZOL組在 RANKL誘導(dǎo)1d后，加用1×10-6mol/L的唑來(lái)膦酸處理2d。細(xì)胞收獲后，進(jìn)行如下檢測(cè)：（1）應(yīng)用抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色及牙本質(zhì)磨片吸收陷窩檢測(cè)評(píng)價(jià)兩組細(xì)胞破骨細(xì)胞生成及骨吸收情況；（2）鈣離子振蕩檢測(cè)：兩組細(xì)胞在1×10-6mol/L的ZOL處理后0h、1h、3h、6h、12h、24h、48h和72h

4、（ZOL去除后24h）、96h（ZOL去除后48h），在激光共聚焦顯微鏡下應(yīng)用熒光染料Fluo-4、Fluo-red檢測(cè)破骨細(xì)胞分化過(guò)程中鈣離子振蕩情況，評(píng)價(jià)唑來(lái)膦酸對(duì)破骨細(xì)胞分化過(guò)程中鈣離子振蕩的影響。（3）兩組細(xì)胞應(yīng)用RANKL誘導(dǎo)5d后，收獲細(xì)胞，分別應(yīng)用Real-time PCR、免疫熒光細(xì)胞化學(xué)、western-blot技術(shù)檢測(cè)兩組細(xì)胞CaMKII、CaMKIV、NFATc1基因表達(dá)情況。
　　結(jié)果：1唑來(lái)膦酸濃度為（1

5、×10-7mol/L、1×10-6mol/L、5×10-6mol/L）時(shí)對(duì)RAW264.7細(xì)胞的增殖不產(chǎn)生影響，沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而濃度為1×10-5mol/L時(shí)對(duì)RAW264.7細(xì)胞的增殖有輕微的抑制作用，但細(xì)胞形態(tài)及大小沒(méi)有明顯變化，而濃度為5×10-5mol/L、1×10-4mol/L對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖受到明顯抑制，細(xì)胞數(shù)目明顯下降，部分細(xì)胞體積變小，部分細(xì)胞發(fā)生崩解，呈碎屑狀（P＜0.01）。2經(jīng)RANKL

6、誘導(dǎo)及唑來(lái)膦酸處理后，對(duì)照組和唑來(lái)膦酸（ZOL）處理組檢測(cè)結(jié)果如下：（1）TRAP染色及牙本質(zhì)磨片吸收陷窩檢測(cè)顯示，兩組細(xì)胞都有TRAP+多核破骨細(xì)胞形成（胞核≥3個(gè)）和有骨吸收陷窩出現(xiàn)，但是唑來(lái)膦酸處理組破骨細(xì)胞數(shù)目、牙本質(zhì)磨片吸收陷窩的數(shù)目和面積分別為33.0±1.0，46.0±3.5和4125.9±674.8μm2，顯著低于對(duì)照組的66.6±3.2，86.0±9.2和9418.3±1260.8μm2（P＜0.05或 P＜0.01）

7、。（2）唑來(lái)膦酸對(duì)鈣離子振蕩的影響具有時(shí)間依賴性：1×10-6mol/L的唑來(lái)膦酸在作用初期（0~3h），對(duì)鈣離子振蕩沒(méi)有明顯的抑制作用；而隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)（6~48h），唑來(lái)膦酸對(duì)鈣離子振蕩產(chǎn)生了明顯的抑制作用，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)抑制作用越來(lái)越明顯；在唑來(lái)膦酸撤除后（72~96h），鈣離子振蕩逐漸恢復(fù)，上升到與對(duì)照相似的水平。（3）Real-time PCR檢測(cè)顯示，唑來(lái)膦酸處理組CaMKII、CaMKIV、NFATc1 mRNA水平

8、較對(duì)照組均顯著降低，分別下降了39.3％和51.7%和54.7%（P＜0.01）。（4）Western-blot檢測(cè)顯示，唑來(lái)膦酸處理組CaMKII、CaMKIV、NFATc1的蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組顯著降低，蛋白條帶灰度值分別下降了58.9％、46.8％和39.8%（P＜0.05）。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)也顯示，唑來(lái)膦酸處理組CaMKII、CaMKIV、NFATc1蛋白熒光強(qiáng)度均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。
　　結(jié)論：研究結(jié)果提