2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、目前,肺癌是全球發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤。肺癌從病理類型上分為小細(xì)胞肺癌(SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)。NSCLC中約50%會發(fā)生腦轉(zhuǎn)移(BM)。本研究通過組織中檢測miR-375在NSCLC腦轉(zhuǎn)移患者中的表達(dá),并與未發(fā)生腦轉(zhuǎn)移的NSCLC患者對照,明確miR-375在腦轉(zhuǎn)移中的作用,為NSCLC腦轉(zhuǎn)移提供早期診斷的分子標(biāo)記物;通過生存及預(yù)后研究,明確miR-375在NSCLC患者尤其是NSCLC腦轉(zhuǎn)移患者中的預(yù)后重要性。

2、通過構(gòu)建miR-375慢病毒載體并轉(zhuǎn)染至非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中,形成穩(wěn)定克隆,探討miR-375對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響,并探討miR-375在NSCLC發(fā)生發(fā)展及發(fā)生腦轉(zhuǎn)移中的可能機(jī)制,為以后開展動物實(shí)驗(yàn)提供較明確的研究方向,未來可能為NSCLC腦轉(zhuǎn)移的治療提供靶點(diǎn)。
  目的:
  (1)檢測miRNA-375在非小細(xì)胞肺癌腦轉(zhuǎn)移和非小細(xì)胞肺癌未發(fā)生腦轉(zhuǎn)移患者組織中的表達(dá)差異,明確miRNA-375在非小細(xì)胞肺癌發(fā)

3、生腦轉(zhuǎn)移中的作用,并分析miRNA-375在NSCLC患者和NSCLC腦轉(zhuǎn)移患者預(yù)后中的作用。
  (2)通過構(gòu)建miR-375和anti-miR-375的病毒質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染至非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中,研究miR-375對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。
  (3)通過檢測miR-375下游蛋白的表達(dá),探索miR-375在非小細(xì)胞肺癌及發(fā)生腦轉(zhuǎn)移中的可能機(jī)制。
  方法:
  (1)MiR-375作用研究收集30例非小

4、細(xì)胞肺癌腦轉(zhuǎn)移患者腫瘤組織標(biāo)本(包括原發(fā)肺癌組織和腦轉(zhuǎn)移瘤組織)及癌旁組織標(biāo)本,通過實(shí)時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR方法(quatitive Real-time PCR,qRT-PCR)檢測miR-375在非小細(xì)胞肺癌腦轉(zhuǎn)移患者肺部原發(fā)灶、腦轉(zhuǎn)移灶、癌旁組織中的表達(dá)情況;收集30例非小細(xì)胞肺癌未發(fā)生腦轉(zhuǎn)移患者的肺癌原發(fā)灶、癌旁組織標(biāo)本,qRT-PCR檢測miR-375的表達(dá)。以上根據(jù)組織來源可分為四組來研究miR-375的表達(dá)水平,即NSCLC

5、腦轉(zhuǎn)移患者腦部轉(zhuǎn)移灶、NSCLC腦轉(zhuǎn)移患者肺部癌組織、NSCLC未發(fā)生腦轉(zhuǎn)移患者肺部癌組織及癌旁組織組。通過t-檢驗(yàn)比較miR-375在NSCLC腦轉(zhuǎn)移和NSCLC未發(fā)生腦轉(zhuǎn)移患者中表達(dá)水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
  (2)統(tǒng)計(jì)方法研究生存、預(yù)后及NSCLC腦轉(zhuǎn)移相關(guān)分子的探索通過方差分析研究miR-375的表達(dá)與患者臨床病理特征(分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腦轉(zhuǎn)移)的關(guān)系。Log-rank檢驗(yàn)和Kaplan-Meier生存曲線比較總生存時間與mi

6、R-375表達(dá)的關(guān)系。應(yīng)用多因素COX回歸模型明確NSCLC患者和NSCLC腦轉(zhuǎn)移患者預(yù)后影響因素。PCR法檢測EGFR、K-ras突變,免疫組化SP法檢測VEGF、MMP-9的表達(dá),應(yīng)用卡方檢驗(yàn)明確EGFR突變、K-ras突變、VEGF表達(dá)、MMP-9表達(dá)與腦轉(zhuǎn)移的關(guān)系,并應(yīng)用t-檢驗(yàn)分析EGFR突變、K-ras突變、VEGF表達(dá)、MMP-9表達(dá)與miR-375表達(dá)的關(guān)系。
  (3)通過EcoRⅠ和BamHⅠ酶切及連接后產(chǎn)生攜

7、帶miR-375-EGFP、anti-miR-375-EGFP和EGFP三個質(zhì)粒,用HIV包被及轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞,后侵染非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞,篩選出3個抗性克隆A549-miR375-GFP、A549-anti-miR375-GFP、A549-GFP,并用A549作為空白對照。通過培養(yǎng)和篩選形成,形成4組穩(wěn)定的細(xì)胞系。MTT法測定細(xì)胞增殖,通過Transwell侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)、劃痕試驗(yàn)研究miR-375對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生物

8、學(xué)特征的影響。
  (4)應(yīng)用體外成管實(shí)驗(yàn)明確miR-375的作用機(jī)制,Western blot法檢測下游VEGF、MMP-2、MMP-9、EGFR的表達(dá),探索miR-375在非小細(xì)胞及腦轉(zhuǎn)移發(fā)生發(fā)展中的可能機(jī)制。
  結(jié)果:
  (1)MiR-375在非小細(xì)胞肺癌腦轉(zhuǎn)移灶、非小細(xì)胞肺癌腦轉(zhuǎn)移患者肺部原發(fā)癌組織、非小細(xì)胞未發(fā)生腦轉(zhuǎn)移患者原發(fā)肺癌組織、癌旁組織表達(dá)量分別為:0.28±0.05,0.47±0.06,0.71

9、±0.13,1.00±0.17。每兩組之間的差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與NSCLC未發(fā)生腦轉(zhuǎn)移的患者相比,NSCLC腦轉(zhuǎn)移患者miR-375的表達(dá)水平呈明顯下調(diào),并且同一NSCLC腦轉(zhuǎn)移患者miR-375在腦轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)低于肺部原發(fā)癌組織,且二者差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);NSCLC未發(fā)生腦轉(zhuǎn)移患者原發(fā)肺癌組織中miR-375的表達(dá)明顯低于癌旁正常組織(P<0.01)。
  (2)MiR-375的低表達(dá)與NSCL

10、C患者的分期晚和腦轉(zhuǎn)移灶數(shù)目增多相關(guān)。對于該研究60例NSCLC患者來說,miR-375低表達(dá)組OS明顯短于高表達(dá)組,且二者差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(log-rank test P<0.01);同樣,對于NSCLC腦轉(zhuǎn)移患者來說,miR-375低表達(dá)組生存時間明顯短于高表達(dá)組(log-rank test P<0.05)。MiR-375的表達(dá)是NSCLC患者獨(dú)立的預(yù)后因子。與NSCLC腦轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子為VEGF和MMP-9的表達(dá),而EGFR和K

11、-ras突變與腦轉(zhuǎn)移無明顯相關(guān);VEGF和MMP-9在miR-375低表達(dá)的患者中呈明顯過表達(dá),而EGFR和K-ras突變與miR-375的表達(dá)水平無關(guān)。
  (3)通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,篩選并培養(yǎng)成功以下四個A549細(xì)胞系:A549-miR-375-GFP、A549-anti-miR-375-GFP、A549-GFP和A549。MTT增殖實(shí)驗(yàn):A549-miR-375-GFP組細(xì)胞的增殖率較A549-GFP(Control)組和A549

12、空白對照組明顯降低,且差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而A549-anti-miR-375-GFP組較空白對照組和Control組增殖率明顯升高(P<0.01)??瞻讓φ战M和陰性對照組(Control組)二者無明顯差別(P>0.05)。而觀察72小時熒光顯微鏡下細(xì)胞增殖最快的為A549-anti-miR-375-GFP組,最慢的為A549-miR-375-GFP組。
  (4)Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,A549細(xì)胞能

13、侵襲穿越基質(zhì)膠。A549-miR-375-GFP組穿膜細(xì)胞數(shù)較少,為75.12±6.21,明顯低于空白組(125±10.27)和Control組(129.51±8.28)(P<0.05);A549-anti-miR-375-GFP組穿膜細(xì)胞數(shù)最多,為199.67±9.23,明顯高于空白組和Control組(P<0.05)。空白組和Control組差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
  (5)Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,A5

14、49-miR-375-GFP組穿膜細(xì)胞數(shù)較少,為50.33±9.32,低于空白組(108±9.38)和Control組(110±7.82)(P<0.05);A549-anti-miR-375-GFP組穿膜細(xì)胞數(shù)最多,為178±10.89,明顯高于空白組和Control組(P<0.05)??瞻捉M和Control組差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
  (6)劃痕實(shí)驗(yàn):A549-miR-375-GFP組、A549-anti-miR37

15、5-GFP、A549-GFP三組分別用100ul無菌槍頭垂直劃痕,記為0小時,24小時候觀察劃痕區(qū)發(fā)現(xiàn)A549-anti-miR375-GFP劃痕區(qū)最小,細(xì)胞幾乎全部侵入;而A549-miR-375-GFP組劃痕區(qū)最大,細(xì)胞遷入明顯最慢,而A549-GFP組劃痕區(qū)范圍居以上二者中間。
  (7)體外成管實(shí)驗(yàn):細(xì)胞系放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中,觀察成管,1周后發(fā)現(xiàn)3D成像,A549--miR375-GFP和A549-GFP組3D成像未發(fā)現(xiàn)成管

16、現(xiàn)象,而A549-anti-miR375-GFP3D成像成管較多。
  (8)Western Blot檢測EGFR、VEGF、MMP-2、MMP-9的表達(dá):VEGF、MMP-2、MMP-9在PC14/B中呈明顯高表達(dá),而在PC14中呈低表達(dá)。A549細(xì)胞系中,A549-miR-375-GFP組VEGF、MMP-2、MMP-9呈低表達(dá),而在A549-anti-miR375-GFP組中VEGF、MMP-2、MMP-9呈明顯過表達(dá),另外

17、A549-GFP組和A549組VEGF、MMP-9無明顯差別,而MMP-2在A549-GFP組中表達(dá)較A549高。EGFR在PC14和PC14/B中無明顯差異,并且在A549細(xì)胞各組之間表達(dá)無明顯差別。
  結(jié)論:
  1.本研究表明miR-375與NSCLC腦轉(zhuǎn)移明顯相關(guān),miR-375的下調(diào)可作為預(yù)測NSCLC腦轉(zhuǎn)移的因子,可用于篩查出腦轉(zhuǎn)移高危人群。MiR-375有望在早期診斷中發(fā)揮作用。
  2.MiR-375

18、的表達(dá)與分期晚和腦轉(zhuǎn)移明顯相關(guān);MiR-375在NSCLC和NSCLC腦轉(zhuǎn)移患者中表達(dá)水平越低,生存時間越短,并且miR-375的表達(dá)水平是NSCLC患者的獨(dú)立預(yù)后因子。
  3.MiR-375的下調(diào)可促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移及血管生成,miR-375可能通過血管生成途徑與非小細(xì)胞肺癌增殖、侵襲甚至腦轉(zhuǎn)移相關(guān)。MiR-375將來可能為非小細(xì)胞肺癌腦轉(zhuǎn)移的治療提供了新的靶點(diǎn)或新的治療藥物。
  4.EGFR突變和

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