TLR2對骨骼肌線粒體生物發(fā)生及胰島素敏感性的影響.pdf

1、近年來對胰島素抵抗（insulin resistance,IR）的病因?qū)W研究成為一個熱點，因為 IR貫穿于高脂血癥、糖尿病、高血壓、痛風(fēng)等多種代謝相關(guān)疾病，是這些疾病的共同土壤。眾多研究資料表明炎癥反應(yīng)是IR發(fā)生的重要機(jī)制。從發(fā)現(xiàn)第一個與胰島素抵抗相關(guān)的炎性細(xì)胞因子腫瘤壞死因子α（TNFα）以來，炎癥機(jī)制已成為肥胖相關(guān)胰島素抵抗的研究熱點。肥胖狀態(tài)下的炎癥是一種低度的慢性炎癥反應(yīng)。TOLL樣受體(Toll-like receptors,

2、 TLRs)作為模式識別受體不僅在感染免疫和損傷誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，還參與代謝相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展。
　　TOLL樣受體2(TLR2)是已克隆出的TOLL樣受體家族中表達(dá)范圍最廣，識別病原微生物種類最多的成員。TLR2主要在哺乳動物的肺臟、心臟、大腦和肌肉組織中表達(dá)，其最突出的生物學(xué)功能就是直接或間接促進(jìn)炎癥因子的合成與釋放。人類及嚙齒類動物血漿葡萄糖60％~70%在骨骼肌代謝，骨骼肌是胰島素刺激葡萄糖攝取的主要部位。

3、r>　　脂代謝在骨骼肌胰島素抵抗形成中扮演重要角色，線粒體是脂肪酸氧化的部位，表明線粒體功能在骨骼肌胰島素抵抗形成中的重要地位。因此研究TLR2對骨骼肌線粒體生物發(fā)生、胰島素抵抗的影響對代謝性疾病的防治具有重要的意義，為尋求糖尿病治療新靶點提供科學(xué)依據(jù)。
　　棕櫚酸(Palmitate acid, PA)是游離脂肪酸中最主要的飽和脂肪酸，用其孵育可致細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗，是建立體外細(xì)胞胰島素抵抗模型的常用方法之一。本課題采用PA孵育

4、L6成肌細(xì)胞構(gòu)建胰島素抵抗模型，并通過質(zhì)粒上調(diào)和siRNA下調(diào)肌細(xì)胞中TLR2的表達(dá)，探究飽和脂肪酸是否是通過TLR2的表達(dá)影響骨骼肌線粒體生物發(fā)生，進(jìn)而導(dǎo)致胰島素抵抗。
　　目的：研究TLR2對棕櫚酸所致骨骼肌胰島素抵抗的作用及其機(jī)制。
　　方法：培養(yǎng)原始L6成肌細(xì)胞，使其分化成骨骼肌細(xì)胞，并用PA孵育，建立胰島素抵抗模型。隨后進(jìn)行如下分組：對照組（control），棕櫚酸組（PA），棕櫚酸siRNA陰性對照組（PA+NC

5、-siRNA），棕櫚酸TLR2敲低組（PA+si-TLR2），棕櫚酸空質(zhì)粒組（PA+pcDNA），棕櫚酸TLR2過表達(dá)組（PA+pcDNA/TLR2）。通過RT-PCR及Western blot方法檢測TLR2 mRNA及蛋白表達(dá)水平，確定轉(zhuǎn)染成功后，用葡萄糖氧化酶法測定各組細(xì)胞培養(yǎng)基中葡萄糖濃度，評價胰島素的敏感性。采用ELISA方法測定六組培養(yǎng)基中炎癥因子TNFα及 IL-1β的濃度。采用 RT-PCR和Western blotti

6、ng方法檢測六組樣本骨骼肌細(xì)胞中TLR2蛋白的表達(dá)水平，采用Western blotting方法檢測六組樣本骨骼肌細(xì)胞中線粒體生物發(fā)生相關(guān)蛋白PGC1α、MFN2、NRF-1以及胰島素信號通路PI3K、P-AKT、GLUT4蛋白的表達(dá)水平。多樣本比較采用單因素方差分析，兩樣本間比較采用t檢驗。
　　結(jié)果：
　　1.成功分化骨骼肌細(xì)胞
　　分化組標(biāo)志性分化基因Desmin和Myogenin的mRNA表達(dá)較未分化組明顯增加

7、，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；
　　2.胰島素抵抗模型的建立
　　成功分化的骨骼肌細(xì)胞，分為正常對照組和棕櫚酸干預(yù)組。分別在12h、16h、20h、24h測定兩組培養(yǎng)基葡萄糖濃度，在24h時，棕櫚酸干預(yù)組葡萄糖濃度明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；
　　3.轉(zhuǎn)染成功后六組樣本葡萄糖濃度及炎癥因子TNFα和IL-1β的變化
　　PA組培養(yǎng)基中葡萄糖濃度及炎癥因子TNFα和IL-1β較con

8、trol組明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；
　　PA+NC-siRNA組和PA+pcDNA組較PA組葡萄糖濃度及炎癥因子TNFα和IL-1β無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；
　　PA+si-TLR2組較PA+NC-siRNA組葡萄糖濃度及炎癥因子TNFα和IL-1β明顯下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；
　　PA+pcDNA/TLR2組較PA+pcDNA組葡萄糖濃度及炎癥因子TNFα

9、和IL-1β明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；
　　4.轉(zhuǎn)染成功后六組樣本TLR2的表達(dá)
　　與control組相比，PA組TLR2的表達(dá)明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；
　　PA+NC-siRNA組和PA+pcDNA組較PA組TLR2的表達(dá)無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；
　　PA+si-TLR2組較PA+NC-siRNA組TLR2的表達(dá)明顯下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<

10、0.05），表明si-TLR2轉(zhuǎn)染成功；
　　PA+pcDNA/TLR2組較PA+pcDNA組TLR2的表達(dá)明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）表明TLR2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功；
　　5.轉(zhuǎn)染成功后六組樣本線粒體生物發(fā)生相關(guān)蛋白指標(biāo)及胰島素信號通路指標(biāo)的變化
　　與control組相比， PA組線粒體生物發(fā)生相關(guān)蛋白指標(biāo)PGC1α、MFN2、NRF-1以及胰島素信號通路PI3K、P-AKT、GLUT4的蛋白表達(dá)水平下降

11、，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；
　　PA+NC-siRNA組和PA+pcDNA組較PA組線粒體生物發(fā)生相關(guān)蛋白指標(biāo)PGC1α、MFN2、NRF-1以及胰島素信號通路PI3K、P-AKT、GLUT4的蛋白表達(dá)水平無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；
　　PA+si-TLR2組較PA+NC-siRNA組線粒體生物發(fā)生相關(guān)蛋白指標(biāo)PGC1α、MFN2、NRF-1以及胰島素信號通路PI3K、P-AKT、GLUT4的

12、蛋白表達(dá)水平升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；
　　PA+pcDNA/TLR2組較PA+pcDNA組線粒體生物發(fā)生相關(guān)蛋白指標(biāo)PGC1α、MFN2、NRF-1以及胰島素信號通路PI3K、P-AKT、GLUT4的蛋白表達(dá)水平下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；
　　結(jié)論：
　　1.高脂孵育可以誘導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞胰島素抵抗，表現(xiàn)為葡萄糖攝取減少，同時可使TLR2增加，炎癥因子TNFα和IL-1β釋放增加。