動(dòng)式吸入納米級(jí)碳黑對(duì)大鼠肺組織的損傷作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：碳黑是一種無(wú)定形碳，由于其穩(wěn)定性的特點(diǎn)，經(jīng)常被用于陰性對(duì)照來(lái)解釋一些納米材料的毒性。納米級(jí)碳黑具有較大的表面積，因而也具有較強(qiáng)的生物學(xué)作用。已有證據(jù)表明納米級(jí)碳黑顆?？烧T導(dǎo)肺部炎癥和組織病理?yè)p傷。國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)將碳黑分類為人類可能致癌物。但其作用機(jī)制仍然不清。外源性異物進(jìn)入機(jī)體后，在對(duì)機(jī)體造成氧化損傷作用的同時(shí)機(jī)體自身也出現(xiàn)抗氧化應(yīng)激保護(hù)機(jī)制。而FOXO家族的轉(zhuǎn)錄因子牽涉細(xì)胞周期阻滯，細(xì)胞死亡和保護(hù)應(yīng)激刺激多個(gè)過程，

2、在抗氧化應(yīng)激修復(fù)損傷中有著重要的作用。本研究通過動(dòng)式吸入染毒的方法，建立碳黑染毒大鼠模型，觀察碳黑對(duì)大鼠肺組織的影響，并以FOXO3a、FOXO1為切入點(diǎn)，對(duì)納米級(jí)碳黑的毒作用機(jī)制進(jìn)行深入研究，探討其導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞毒作用靶點(diǎn)，尋找切實(shí)可行的預(yù)防控制方法。
　　方法：
　　1.使用Tecnai G220透射電子顯微鏡測(cè)量納米級(jí)碳黑顆粒的尺寸和形態(tài)；并通過掃描電子顯微鏡觀察其表面形態(tài)。使用Brunauer-Emmett-Telle

3、r(BET)吸附等溫式計(jì)算納米級(jí)碳黑顆粒的比表面積。
　　2.48只健康SD雄性大鼠，體重150-180g，隨機(jī)分為兩組，每組24只。建立大鼠動(dòng)式吸入染毒模型，實(shí)驗(yàn)組每天吸入納米級(jí)碳黑顆粒6h，濃度為30mg/m3，染毒14天28天和恢復(fù)14天后每組分別處死8只動(dòng)物留取肝、腎、心、腦、肺組織于-80℃冰箱凍存。
　　3.在染毒過程中每隔3天記錄一次大鼠的體重，比較實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間大鼠體重變化差異，并觀察大鼠一般體征。腹主動(dòng)脈

4、取血后處死動(dòng)物，處死前稱重，并稱量各臟器重量計(jì)算臟器系數(shù)。
　　4.肺組織形態(tài)及病理學(xué)觀察：碳黑吸入染毒不同時(shí)間段大鼠的肺組織的外觀形態(tài)發(fā)生顯著改變，制作肺組織病理切片，光鏡下觀察納米級(jí)碳黑顆粒染毒后肺的病理變化。
　　5.碳黑在肺組織中的沉積率和清除率：根據(jù)計(jì)算公式Lung burden=(MV)×(T)×(CON)×(DF)=(7.3ml/min)(360min)(30mg/m3)(33.8％)(MV為大鼠通氣量，T為每

5、天暴露時(shí)間，CON為染毒罐內(nèi)碳黑濃度，DF為可進(jìn)入肺泡的碳黑量占總碳黑量的百分比)計(jì)算碳黑在肺內(nèi)的沉積量。比較肺組織病理切片內(nèi)納米級(jí)碳黑顆粒的分布及不同時(shí)間點(diǎn)的含量計(jì)算清除率。
　　6.大鼠肺組織氧化應(yīng)激水平的測(cè)定：利用試劑盒檢測(cè)納米級(jí)碳黑顆粒染毒后，大鼠肺組織中SOD、GSH-Px活力以及MDA含量的變化。將肺組織細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，使用2,7-二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉(2,7-ddichlorodihydrf-luorescei

6、n diacetate，DCFH-DA)熒光探針孵育，流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組肺組織細(xì)胞活性氧(reactive oxygen species，ROS)含量。
　　7.大鼠肺組織細(xì)胞凋亡的測(cè)定：Tunel法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。Tunel法可使用石蠟包埋肺組織切片，對(duì)完整的單個(gè)凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色，檢測(cè)納米級(jí)碳黑顆粒染毒后，肺組織內(nèi)凋亡細(xì)胞的數(shù)量。
　　8.大鼠肺組織DNA損傷的測(cè)定：運(yùn)用彗星試驗(yàn)(SCGE

7、)，檢測(cè)納米級(jí)碳黑顆粒染毒后，大鼠肺組織細(xì)胞OTM值和TailDNA%的變化。
　　9.納米級(jí)碳黑顆粒對(duì)大鼠肺組織中FOXO蛋白表達(dá)的影響免疫組化：對(duì)FOXO3a、P-FOXO3a、FOXO1及P-FOXO1進(jìn)行定位、定性及定量的研究， Western blot：檢測(cè)FOXO3a、P-FOXO3a、FOXO1及P-FOXO1蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.納米級(jí)碳黑顆粒的特征
　　通過掃描電子顯微鏡(SEM)

8、和透射電子顯微鏡(TEM)證實(shí)碳黑(CB)的尺寸為30到50nm的球形顆粒組成了數(shù)十到數(shù)百納米的聚集體，但無(wú)中間體。BET結(jié)果顯示CB顆粒比表面積約為74.85m2/g。
　　2.大鼠的一般狀況
　　在實(shí)驗(yàn)過程中，實(shí)驗(yàn)大鼠全部存活，一般情況良好；在染毒和恢復(fù)期間沒有觀察到納米級(jí)碳黑顆粒的明顯毒性作用。實(shí)驗(yàn)組大鼠進(jìn)食及飲水正常，精神狀態(tài)良好。
　　3.碳黑對(duì)大鼠體重的變化影響
　　碳黑染毒28天的過程中，染毒組的體

9、重增長(zhǎng)速度略低于非暴露組，兩組的體重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　4.大鼠的肺臟器系數(shù)變化
　　臟器系數(shù)分析碳黑吸入染毒14天后，肺的絕對(duì)重量與肺的臟器系數(shù)同對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，在吸入染毒28天后，肺的絕對(duì)重量與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，肺的臟器系數(shù)顯著增加(P＜0.05)，恢復(fù)14天后，肺的臟器系數(shù)仍顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。其他臟器的臟器系數(shù)均無(wú)明顯變化。
　　5.

10、碳黑在肺組織中的沉積率和清除率
　　碳黑染毒14天、28天后，每只大鼠肺部碳黑的理論沉積量為373.03mg、746.06mg。碳黑染毒28天后，碳黑顆粒大部分沉積于肺間質(zhì)內(nèi)，少量存在于肺泡間，在恢復(fù)14天后碳黑可被清除為28天的82.5%，且與染毒28天相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　6.大鼠肺組織的病理變化
　　對(duì)照組，光鏡下觀察支氣管上皮排列整齊管腔規(guī)則，呼吸性細(xì)支氣管和周圍肺泡、血管等組織結(jié)構(gòu)，纖毛

11、完整無(wú)脫落，管腔內(nèi)無(wú)滲出物。染毒14天和28天后，大鼠肺組織內(nèi)碳黑顆粒增多，肺泡壁增厚。肺泡腔內(nèi)可見較多的巨噬細(xì)胞，單核細(xì)胞增多，聚集成團(tuán)，吞噬黑色碳黑顆粒增多。恢復(fù)期染毒組大鼠病變程度與14天染毒組相似，仍觀察到肺泡間質(zhì)內(nèi)中有許多碳黑顆粒分布，但無(wú)大量炎性細(xì)胞。
　　7.大鼠肺組織細(xì)胞凋亡的變化
　　Tunel法檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，納米級(jí)碳黑顆粒染毒14天與28天后，與對(duì)照組相比，染毒組細(xì)胞凋亡比例略有增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)

12、意義(P<0.05)?；謴?fù)14天后與染毒28天相比細(xì)胞凋亡比例略有降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　8.納米級(jí)碳黑顆粒對(duì)大鼠肺組織氧化應(yīng)激水平的影響
　　與對(duì)照組相比，納米級(jí)碳黑染毒14天和28天后大鼠肺組織 SOD、GSH-Px活力均顯著降低(P<0.05)。MDA含量顯著升高(P<0.05)，恢復(fù)組SOD、GSH-Px活力均高于染毒組(P<0.05)，MDA含量有所降低(P<0.05)。
　　流式細(xì)胞

13、儀檢測(cè)ROS結(jié)果顯示，納米級(jí)碳黑染毒14天和28天后，大鼠肺組織ROS水平顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，恢復(fù)組與28天染毒組相比有所降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　9.納米級(jí)碳黑顆粒對(duì)大鼠肺組織DNA損傷的影響
　　納米級(jí)碳黑顆粒染毒14天后，大鼠肺組織中TailDNA%同對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，OTM值與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。

14、在吸入染毒28天后，大鼠肺組織中TailDNA%與對(duì)照組相比均顯著增加(P<0.05)；OTM值與對(duì)照組相比均顯著增加(P<0.05)?；謴?fù)14天后TailDNA%與OTM值與28天染毒組相比均有明顯降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　10、納米級(jí)碳黑顆粒對(duì)大鼠肺組織中FOXO3a、P-FOXO3a、FOXO1及P-FOXO1蛋白表達(dá)的影響
　　與對(duì)照組相比，納米級(jí)碳

15、黑染毒14天與28天后大鼠肺組織中FOXO3a與FOXO1蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，并且其主要在細(xì)胞核表達(dá)，且隨著染毒時(shí)間的增加表達(dá)量增加?；謴?fù)組與28天染毒組相比FOXO3a與FOXO1蛋白表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；恢復(fù)組與對(duì)照組相比，大鼠肺組織FOXO3a與FOXO1蛋白表達(dá)量的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。染毒14天P-FOXO3a蛋白表達(dá)量與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，染毒28天P-FOXO3a蛋白表達(dá)量與對(duì)照

16、組相比升高(P<0.05)，且在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核內(nèi)均有表達(dá)，恢復(fù)組與對(duì)照組相比P-FOXO3a蛋白表達(dá)量的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。與對(duì)照組相比，染毒14天和28天后，大鼠肺組織P-FOXO1蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核內(nèi)均有表達(dá)，恢復(fù)14天與對(duì)照組相比P-FOXO1蛋白表達(dá)量的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1.建立大鼠動(dòng)式吸入納米級(jí)碳黑染毒模型，在28天動(dòng)式吸入染毒過程中，實(shí)驗(yàn)組大鼠體重增

17、長(zhǎng)略低于對(duì)照組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.大鼠吸入納米級(jí)碳黑后，大部分沉積于肺間質(zhì)內(nèi)，少量存在于肺泡間，在停止染毒并恢復(fù)14天后肺間質(zhì)內(nèi)碳黑幾乎不能被清除，表明碳黑在進(jìn)入肺組織后短期內(nèi)不能被清除。
　　3.納米級(jí)碳黑顆粒經(jīng)呼吸道染毒后可使大鼠肺組織出現(xiàn)不同程度的病理變化，且隨著染毒時(shí)間的增加病變加重。并引起肺細(xì)胞的凋亡和壞死。
　　4.納米級(jí)碳黑顆粒染毒后，可使大鼠肺組織細(xì)胞發(fā)生氧化損傷，抗氧化能力受損，14天后可緩