低強(qiáng)度脈沖超聲防治激素誘導(dǎo)股骨頭壞死的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、股骨頭壞死是骨科較為常見(jiàn)的一種疾病。由于患病者大多為中青年，而且該疾病的致殘率極高，對(duì)患者家庭和社會(huì)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)均較大。有研究指出，在未經(jīng)治療的情況下，股骨頭壞死的患者80％最終會(huì)發(fā)生股骨頭塌陷，進(jìn)一步繼發(fā)骨關(guān)節(jié)炎，最終須行關(guān)節(jié)置換術(shù)緩解疼痛、改善功能。雖然近年來(lái)人工關(guān)節(jié)置換術(shù)有了長(zhǎng)足的發(fā)展，但是由于患者多為中青年，絕大多數(shù)患者需接受至少1次以上的翻修術(shù)，且術(shù)后功能欠理想。因此，近年來(lái)把股骨頭壞死治療的重點(diǎn)集中到了早期治療上，目的主要在于

2、預(yù)防股骨頭塌陷，防止髖關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)改變。然而，到目前為止，尚無(wú)任何治療方法可以確切有效的達(dá)到以上目的。
　　低強(qiáng)度脈沖超聲是一種具有生物聲學(xué)效應(yīng)的機(jī)械波。因其高效、無(wú)創(chuàng)的優(yōu)勢(shì)，被美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于骨不愈的治療。大量的研究發(fā)現(xiàn)LIPUS可以促進(jìn)骨生長(zhǎng)，改善局部血供，促進(jìn)成骨細(xì)胞活性和間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化。這一系列的作用機(jī)制，或許在股骨頭壞死早期修復(fù)過(guò)程中可以發(fā)揮積極的促進(jìn)作用。
　　本人博士期間一直從事生物聲學(xué)效應(yīng)和股骨頭壞死早

3、期非手術(shù)治療方面的研究。已有多篇SCI論文發(fā)表。本實(shí)驗(yàn)分為五個(gè)部分:一、成功構(gòu)建與臨床特點(diǎn)相似的兔早期股骨頭壞死模型;二、探討低強(qiáng)度脈沖超聲防治早期股骨頭壞死的作用;三、在低強(qiáng)度脈沖超聲治療兔股骨頭壞死過(guò)程中，觀察股骨頭內(nèi)骨形態(tài)蛋白2（BMP-2）、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)及其基因的動(dòng)態(tài)表達(dá)情況。四、應(yīng)用不同能量強(qiáng)度的超聲治療股骨頭壞死，探尋療效最佳的超聲能量強(qiáng)度。五、通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，研究微泡劑增強(qiáng)超聲生物效應(yīng)機(jī)制的作用。我們的研

4、究表明，低強(qiáng)度脈沖超聲或可以阻止或延緩激素誘導(dǎo)早期股骨頭壞死疾病的進(jìn)程;BMP-2和VEGF或許在該療效的機(jī)制中有重要作用;100-200 mW/cm2強(qiáng)度的療效優(yōu)于高強(qiáng)度超聲(1W/cm2)。微泡劑或可進(jìn)一步增強(qiáng)超聲的生物效應(yīng)。
　　第一部分:兔股骨頭壞死模型的誘導(dǎo)和鑒定
　　目的:建立與人股骨頭壞死病變過(guò)程類(lèi)似，簡(jiǎn)單、可靠的激素誘導(dǎo)的兔股骨頭壞死模型。
　　方法:取16只兔子，隨機(jī)對(duì)半分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行

5、造模，采用單次低劑量?jī)?nèi)毒素（10μg/kg）聯(lián)合三次甲基強(qiáng)的松龍針(20mg/kg)的方法，每次用藥間隔24小時(shí)。對(duì)照組注射同樣劑量的生理鹽水。將動(dòng)物最后一次注射激素后6周靜脈注射過(guò)量戊巴比妥處死。取股骨頭標(biāo)本做組織病理學(xué)分析，結(jié)合影像學(xué)、骨密度和生物力學(xué)鑒定股骨頭壞死模型是否成功建立。
　　結(jié)果:6周內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均無(wú)兔子死亡。組織病理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組股骨近端有壞死灶(7/8)，可見(jiàn)骨髓壞死和大量空骨陷窩。對(duì)照組標(biāo)本均未見(jiàn)壞

6、死灶。實(shí)驗(yàn)組的骨小梁結(jié)構(gòu)紊亂，小梁厚度明顯降低，空骨陷窩率明顯增高，大量骨髓壞死組織。對(duì)照組骨小梁結(jié)構(gòu)正常，有序。X線檢查兩組均無(wú)股骨頭塌陷發(fā)生。磁共振掃描可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組股骨近端異常信號(hào)，而對(duì)照組未見(jiàn)異常信號(hào)。實(shí)驗(yàn)組骨密度顯著低于對(duì)照組。
　　結(jié)論:使用內(nèi)毒素+甲強(qiáng)龍的方法，能成功誘導(dǎo)兔早期股骨頭壞死模型。且方法簡(jiǎn)單、可靠，重復(fù)性較高。
　　第二部分:低強(qiáng)度脈沖超聲防治激素誘導(dǎo)早期股骨頭壞死
　　目的:大劑量激素的使用是股

7、骨頭壞死的最主要病因，但是目前臨床上仍缺少有效的措施預(yù)防和治療該疾病。低強(qiáng)度脈沖超聲是美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于治療骨不愈合的一項(xiàng)有效的無(wú)創(chuàng)治療方法。大量研究發(fā)現(xiàn)低強(qiáng)度超聲可以促進(jìn)骨生長(zhǎng)和血管生成，因此本研究的目的在于探討超聲是否可以防治早期股骨頭壞死。
　　方法:使用內(nèi)毒素+甲強(qiáng)龍的方法誘導(dǎo)24只兔子雙側(cè)股骨頭壞死模型。每只兔子的左側(cè)髖部用超聲干預(yù)，定為超聲治療組。超聲干預(yù)強(qiáng)度為200mW/cm2，20min/day。右側(cè)定為對(duì)照組，不

8、予超聲干預(yù)。超聲治療12周后，處死所有兔子，取出標(biāo)本進(jìn)行Micro-CT，生物力學(xué)，組織學(xué)，免疫組化等檢查內(nèi)容。
　　結(jié)果:12周后，生物力學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)對(duì)照組的最大抗壓力為355±38 N，超聲治療組為441±78 N(p＜0.05);Micro-CT發(fā)現(xiàn)超聲組bone volume/total volume為49.29％±12.37％，高于對(duì)照組(p=0.022)37.93％±8.37％;超聲組空骨陷窩率17％±4％，低于(p=0

9、.002)對(duì)照組的26％±9％.超聲組的礦化形成率(2.3±0.8μm/day高于(p=0.001)對(duì)照組的1.6±0.3μm/day.超聲組血管數(shù)量為7.8±3.6/mm2，多于(p=0.025)對(duì)照組的5.7±2.6/mm2。
　　結(jié)論:低強(qiáng)度脈沖超聲可以促進(jìn)骨修復(fù)和血管生成，可以防治激素誘導(dǎo)的早期股骨頭壞死。
　　第三部分:LIPUS對(duì)壞死股骨頭內(nèi)VEGF和BMP-2及其基因表達(dá)的影響
　　目的:本文第二部分用實(shí)

10、驗(yàn)證實(shí)了低強(qiáng)度脈沖超聲可以防治激素誘導(dǎo)早期股骨頭壞死。本研究的目的旨在進(jìn)一步深化研究LIPUS的作用機(jī)制。應(yīng)用低強(qiáng)度脈沖超聲治療早期股骨頭壞死，觀察股骨頭內(nèi)VEGF和BMP-2及其基因的動(dòng)態(tài)表達(dá)情況。
　　方法:使用內(nèi)毒素+甲強(qiáng)龍的方法誘導(dǎo)32只兔子股骨頭壞死模型。隨機(jī)選取2只在肌注甲強(qiáng)龍4周后處死，取股骨近端標(biāo)本行組織病理學(xué)分析，鑒定骨壞死是否成功誘導(dǎo)。其余30兔子的左側(cè)髖部用超聲干預(yù)，定為超聲治療組。超聲干預(yù)強(qiáng)度為200mW/

11、cm2，20min/day。右側(cè)定為對(duì)照組，不予超聲干預(yù)。在超聲治療1周，2周，4周，8周，12周時(shí)各隨機(jī)處死6只兔子，取出股骨頭標(biāo)本用實(shí)時(shí)定量PCR，Westem blot檢測(cè)VEGF和BMP-2及其基因的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:激素肌注4周后，經(jīng)過(guò)組織病理學(xué)分析，壞死誘導(dǎo)成功。經(jīng)過(guò)實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)，超聲組VEGF mRNA在治療后1，2，4周時(shí)的表達(dá)均高于對(duì)照組（P均＜0.05）。超聲組BMP-2 mRNA在治療后1-8周均高于對(duì)

12、照組（P均＜0.05）。超聲組VEGF蛋白表達(dá)量在治療后1-8周均高于對(duì)照組（P均＜0.05）。超聲組BMP-2蛋白表達(dá)量在超聲治療后1-12周均高于對(duì)照組（P均＜0.05）。
　　結(jié)論:在一定時(shí)間內(nèi)，低強(qiáng)度脈沖超聲可以提高VEGF和BMP-2及其基因的表達(dá)。
　　第四部分:比較不同強(qiáng)度LIPUS防治激素誘導(dǎo)股骨頭壞死療效的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:LIPUS可以促進(jìn)骨組織修復(fù)，但是其療效與參數(shù)密切相關(guān)。本文通過(guò)早期股骨頭壞

13、死模型，探討不同強(qiáng)度LIPUS防治股骨頭壞死療效的差異。
　　方法:使用內(nèi)毒素+甲強(qiáng)龍的方法誘導(dǎo)24只兔子雙側(cè)股骨頭壞死模型。隨機(jī)等分為3組(n=8)，分別為低強(qiáng)度(100mW/cm2)組、中強(qiáng)度組(200mW/cm2)和高強(qiáng)度組(1 W/cm2)。每只兔子的雙側(cè)髖部均使用超聲干預(yù)。超聲干預(yù)20 min/day。在治療12周后，處死所有兔子，取出標(biāo)本進(jìn)行生物力學(xué)，組織學(xué)，免疫組化等檢查。
　　結(jié)果:12周后，生物力學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)

14、高強(qiáng)度組最大抗壓載荷低于低強(qiáng)度組和中強(qiáng)度組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。病理組織學(xué)分析發(fā)現(xiàn)高強(qiáng)度組骨小梁面積百分比低于低強(qiáng)度和中強(qiáng)度組(p＜0.05)，高強(qiáng)度組的空骨陷窩率低于低強(qiáng)度組和中強(qiáng)度組(p＜0.05)，而低強(qiáng)度組和中強(qiáng)度組在兩組數(shù)據(jù)之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。高強(qiáng)度組血管數(shù)量少于低強(qiáng)度組和中強(qiáng)度組(p＜0.05)，低強(qiáng)度和中強(qiáng)度組的血管數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論:低強(qiáng)度脈沖超聲強(qiáng)

15、度為100mW/cm2和200mW/cm2時(shí)防治股骨頭壞死療效優(yōu)于強(qiáng)度為1 W/cm2的療效。
　　第五部分:微泡超聲增強(qiáng)慶大霉素對(duì)大腸桿菌的抗菌作用
　　目的:大腸桿菌是內(nèi)植物感染的常見(jiàn)致病菌之一，低強(qiáng)度超聲被發(fā)現(xiàn)可以增強(qiáng)抗菌藥物的抗菌效能，本實(shí)驗(yàn)旨在觀察微泡是否可以進(jìn)一步增強(qiáng)超聲與慶大霉素抑制大腸桿菌的協(xié)同效能，并探討其可能機(jī)制。
　　方法:配制107 CFU/ml大腸桿菌(ATCC25922)懸液，分為空白對(duì)照組

16、、微泡(Sonovue)組、超聲組和微泡超聲組，每組按照慶大霉素濃度進(jìn)一步分為0、1、2μg/ml三個(gè)亞組(n=8)，微泡濃度:10％(v/v)，超聲輻照強(qiáng)度:300mW/cm2，頻率:46.5KHz，占空比:33％，輻照時(shí)間:12h，平板計(jì)數(shù)法比較各組殘留活菌密度，取對(duì)數(shù)(log10 CFU/ml)，行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。每組另取部分菌液行透射電鏡掃描，觀察殘留菌的微觀形態(tài)。
　　結(jié)果:無(wú)慶大霉素時(shí)，4組殘留菌量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;慶大霉

17、素1μg/ml時(shí)，微泡超聲組(5.44±0.49 log10 CFU/ml)與空白對(duì)照組（7.44±0.64 log10 CFU/ml）、微泡組（6.86±0.29 log10 CFU/ml）、超聲組（7.19±0.38log10 CFU/ml）的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;慶大霉素濃度為2μg/ml時(shí)，微泡超聲組（2.87±0.28 log10 CFU/ml）的菌量與空白對(duì)照組（4.45±0.43 log10 CFU/ml）、微泡組（4.33

18、±0.40 log10 CFU/ml）、超聲組（3.89±0.37 log10 CFU/ml）仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。上述藥物濃度時(shí)微泡組與空白對(duì)照組的菌量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。慶大霉素濃度為1μg/ml和2μg/ml時(shí)，微泡超聲組殘留菌量均低于另外三組，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。透射電鏡提示，與單純超聲輻照相比，微泡超聲輻照可進(jìn)一步改變細(xì)菌胞膜的形態(tài)，胞膜皺褶更顯著，存在較多不連續(xù)。
　　結(jié)論:與單純超聲輻照相比，微泡超聲可