健脾補(bǔ)腎方防治家兔激素性股骨頭壞死的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、1研究目的
　　 研究探討健脾補(bǔ)腎方防治SINFH的有效途徑和作用靶點(diǎn),以便更好的指導(dǎo)臨床應(yīng)用,提高臨床療效,發(fā)揮中醫(yī)藥防治SINFH的優(yōu)勢(shì)。
　　 2研究方法
　　 健康成年家兔50只隨機(jī)分為5組(n=10):模型組、空白對(duì)照組、健脾補(bǔ)腎高劑量組(簡(jiǎn)稱高劑量組)、健脾補(bǔ)腎中劑量組(簡(jiǎn)稱中劑量組)和健脾補(bǔ)腎低劑量組(簡(jiǎn)稱低劑量組)。模型組及觀察組按Matsui方法結(jié)合前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果復(fù)制家兔SINFH模型,即以甲潑

2、尼龍琥珀酸鈉20mg/kg/d的劑量臀肌注射,連續(xù)3天,同時(shí)予青霉素2萬(wàn)u/kg肌注,每周2次,預(yù)防感染。各治療組動(dòng)物分別以高(5.52g/kg/d)、中(2.76 g/kg/d,相當(dāng)于60kg體重成人每千克所需劑量的2.3倍)、低(1.38g/kg/d)劑量灌胃健脾補(bǔ)腎方湯藥,連續(xù)12周。模型組與空白對(duì)照組灌胃蒸餾水5g/kg/d,連續(xù)12周。
　　 在首次給藥后的1、4、8和12周,灌胃后12小時(shí),采血檢測(cè)血脂TG、CHO、

3、HDL、LDL和PT、APTT、AT-III等凝血指標(biāo)。末次采血后處死全部動(dòng)物,取雙側(cè)股骨頭連同干骺端組織行HE染色,光鏡下觀察骨小梁、骨細(xì)胞、髓腔脂肪細(xì)胞的變化。在Image-pro plus4.5圖形分析系統(tǒng)下定量觀察,求出空骨陷窩率以及脂肪組織面積。石蠟切片行masson染色,Image-pro plus4.5圖形分析系統(tǒng)下定量觀察軟骨及骨小梁內(nèi)膠原分布并計(jì)算綠染的膠原面積。
　　 末次給藥后以健脾補(bǔ)腎高劑量組和空白對(duì)照組

4、為動(dòng)物來(lái)源制備含藥血清,冷存?zhèn)溆?。?2周處死動(dòng)物前,于空白組任取2只家兔分離得到MSCs。取經(jīng)鑒定和純化的第3代細(xì)胞,隨機(jī)分為健脾補(bǔ)腎加成骨組、成骨組、健脾補(bǔ)腎組和空白對(duì)照組4組,各組以相應(yīng)培養(yǎng)液培養(yǎng)。分別于誘導(dǎo)后的第2、4、8、12、16天,各誘導(dǎo)組進(jìn)行ALP活性的檢測(cè)；更換培養(yǎng)液22d后,各組標(biāo)本用四環(huán)素標(biāo)記法行礦化結(jié)節(jié)染色,光鏡下計(jì)數(shù)鈣結(jié)節(jié)的數(shù)量。
　　 采用SPSS12.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,組間計(jì)量資料數(shù)據(jù)比較采用

5、單因素方差分析,組間股骨頭壞死率的比較采用卡方檢驗(yàn)；計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±S)表示,P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3研究結(jié)果
　　 3.1血液學(xué)檢測(cè)
　　 模型組與正常對(duì)照組比較,4w、8w和12w時(shí)上述各項(xiàng)血脂和凝血指標(biāo)差異顯著或非常顯著(P<0.05或P<0.01)；各治療組與模型組比較,在治療后的4w和(或)8w和(或)12w,上述各項(xiàng)指標(biāo)差異顯著或非常顯著(P<0.05或P<0.01)

6、。各治療組的治療作用具有劑量依賴性。
　　 3.2組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果及病理分級(jí)結(jié)果
　　 HE染色結(jié)果:各組空骨陷窩率由大到小排列為模型組>低劑量組>中劑量組>高劑量組>空白組。正常空白對(duì)照組無(wú)一例出現(xiàn)SINFH,模型組12w時(shí)有7只出現(xiàn)SINFH,發(fā)生率為77.8％(7/9),與正常對(duì)照組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。各治療組發(fā)生率分別為:高劑量組22.2％(2/9)且病理分級(jí)均為Ⅰ級(jí),與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

7、(P<0.05)；中劑量組50％(5/10)、低劑量組70％(7/10),與模型組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各治療組間SINFH發(fā)生率比較:高劑量組與低劑量組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而高劑量與中劑量組及中劑量與低劑量組之間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 Masson染色結(jié)果:正常對(duì)照組骨小梁綠染極少,主要為紅染；模型組與正常對(duì)照組比較,模型組骨小梁中以及邊緣可見(jiàn)大量綠染膠原,膠原面積相比具有顯著差異(P<0.01)；

8、各治療組與模型組比較骨小梁綠染面積明顯減少(P<0.01),組織以紅染為主；治療組間綠染的膠原面積高劑量組與低劑量組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而高劑量與中劑量組及中劑量與低劑量組之間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3.3健脾補(bǔ)腎方藥物血清對(duì)MSCs定向分化的影響
　　 ALP活性檢測(cè)結(jié)果:更換相應(yīng)培養(yǎng)液的第8、12和16天時(shí),空白對(duì)照組與健脾補(bǔ)腎加成骨組和成骨組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；12天時(shí),空白對(duì)照組與健

9、脾補(bǔ)腎組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；從第8天之后,健脾補(bǔ)腎加成骨組ALP活性高于成骨組(P<0.05)；各組在12天ALP活性最高,12天時(shí)按ALP活性由高到低排列為健脾補(bǔ)腎加成骨組>成骨組>健脾補(bǔ)腎組>空白對(duì)照組。
　　 礦化結(jié)節(jié)四環(huán)素?zé)晒鈽?biāo)記結(jié)果:更換培養(yǎng)液22d后,健脾補(bǔ)腎加成骨組、成骨組及健脾補(bǔ)腎組每個(gè)標(biāo)本染色后均可見(jiàn)到大小不一、圓形或不規(guī)則的金黃色結(jié)節(jié),形成的金黃色結(jié)節(jié)在熒光強(qiáng)度、大小、數(shù)量上都明顯優(yōu)于空白對(duì)照組

10、,在空白對(duì)照組所有標(biāo)本中僅偶見(jiàn)。計(jì)數(shù)形成的鈣結(jié)節(jié)數(shù)量,與空白對(duì)照組比較,其余3組形成的鈣結(jié)節(jié)數(shù)量明顯多于空白組,差異非常明顯(P<0.01)；健脾補(bǔ)腎加成骨組鈣結(jié)節(jié)數(shù)量多于成骨組(P<0.05)。各組形成的鈣結(jié)節(jié)數(shù)量由多到少排列為:健脾補(bǔ)腎加成骨組>成骨組>健脾補(bǔ)腎組>空白對(duì)照組。
　　 4結(jié)論
　　 4.1連續(xù)三次大劑量注射LPS可成功復(fù)制家兔的SINFH模型,此方法簡(jiǎn)單易于實(shí)行且家兔中途死亡率低,值得推薦。