人類microRNA基因DNA和RNA水平變異系統(tǒng)分析.pdf

1、microRNA(miRNA)是一類廣泛存在的長約22個核苷酸左右的小分子非編碼RNA。它通過與蛋白編碼基因的mRNA3’端非翻譯區(qū)(3’UTR)堿基互補結(jié)合從而抑制mRNA翻譯或者介導(dǎo)mRNA降解,在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達。作為一類重要的基因表達調(diào)控因子,miRNA廣泛地參與動植物的生長發(fā)育及疾病的發(fā)生發(fā)展等各種生物學(xué)過程。研究發(fā)現(xiàn),miRNA基因DNA水平的單核苷酸多態(tài)性(Singlenucleotidepolymorphism,

2、SNP)和RNA水平的編輯(editing)、堿基添加(addition)、剪切位點變異和表達量等變化都可能影響其功能,從而影響各種生物學(xué)過程。目前對于這些miRNA功能影響因素的研究大多是對少數(shù)候選miRNA、單組織或者單樣本開展的,系統(tǒng)地進行多組織和多樣本的全基因組水平的分析研究還很少。
　　本研究采用系統(tǒng)生物學(xué)和生物信息學(xué)的思想和技術(shù),充分整合目前已有的公共數(shù)據(jù),從全基因組DNA水平研究影響miRNA功能的SNPs;在多組織

3、和多樣本中研究RNA水平影響miRNA功能的RNA編輯、堿基添加、剪切位點變化和表達量變化;并對這些變化的特點和功能進行分析和總結(jié),取得了以下重要研究結(jié)果。
　　首先,本研究利用公共數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù),鑒定出DNA水平上可能影響miRNA表達或(和)miRNA/靶基因結(jié)合的SNPs。通過對人類所有的miRNA基因和SNP在染色體上的位置信息進行比較,我們在人類miRNA基因上找到757個SNPs,其中50個SNPs位于人類的miRNA

4、種子區(qū)域,在蛋白編碼基因mRNA3’UTR區(qū)域找到了225,759個SNP。SNP密度分析顯示miRNA基因序列較鄰近區(qū)域序列更保守,種子區(qū)域SNP密度最低;保守miRNA和成簇miRNA的SNP密度也低于非保守和非成簇miRNA。運用兩種靶基因預(yù)測方法預(yù)測這些SNPs對miRNA/靶基因結(jié)合的影響,結(jié)果表明miRNA種子區(qū)域的SNP對miRNA的影響巨大,一旦發(fā)生,不僅可能影響miRNA的產(chǎn)量,還會造成約一半的靶基因譜發(fā)生變化。在mR

5、NA3’UTR區(qū)域找到的SNP中,有98,008個可以通過破壞miRNA/靶基因結(jié)合或者創(chuàng)造新的miRNA/靶基因結(jié)合位點,從而影響miRNA的調(diào)節(jié)功能。
　　進一步,我們把收集的數(shù)據(jù)和分析結(jié)果導(dǎo)入到MySQL數(shù)據(jù)庫,建立了一個簡單、易用、美觀的網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫miRNASNP(http://www.bioguo.org/miRNASNP/)。為了驗證miRNA基因上SNP對miRNA/靶基因結(jié)合的影響,我們挑選了11個預(yù)測結(jié)果進行熒光

6、素酶實驗,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中8個與預(yù)測結(jié)果相符,并首次實驗證明miRNA上的SNP可以使miRNA產(chǎn)生新的結(jié)合位點。
　　最后,我們運用meta分析方法對影響miRNA功能的RNA水平的編輯、堿基添加、剪切位點變化和表達量變化等進行了系統(tǒng)分析。利用我們建立的miRNA高通量分析流程,對公共數(shù)據(jù)庫中已發(fā)布的741個小RNA高通量測序數(shù)據(jù)進行去低質(zhì)量、篩選和均一化處理,最后保留了400多個高質(zhì)量的數(shù)據(jù)并對它們進行了詳細分析。深入分析發(fā)現(xiàn)實際

7、測序的miRNA數(shù)據(jù)中,存在大量的miRNA異構(gòu)體,這些異構(gòu)體可能是由于RNA水平的編輯、添加、剪切位點變化和序列降解等原因造成。對于每一種情況分析表明:miRNA添加主要以AU兩種堿基為主;RNA編輯除了A?G這一常見類型外,還發(fā)現(xiàn)了大量的其它編輯類型;剪切位點改變有可能使5’端序列發(fā)生位移而改變種子區(qū)域序列;比參考miRNA序列更短的降解序列大量存在。另外,表達譜分析表明:平均每個樣本中,70％的人類已知miRNA完全不表達或者表達

8、非常低,21%的miRNA處于一般表達水平,只有9%的miRNA處于高表達狀態(tài)。這提示實驗者在研究靶基因相關(guān)的miRNA或者進行網(wǎng)絡(luò)分析時需要密切關(guān)注miRNA的表達量,避免引入在某個組織或疾病中根本不表達的miRNA。不同組織或者疾病的miRNA表達和異構(gòu)體表達也具有特異性,異構(gòu)體也可能成為一種新的疾病標志物。
　　本研究通過系統(tǒng)分析DNA和RNA水平上的miRNA變異情況及其對功能的影響,為深入研究miRNA提供了新的方法和思