ATP敏感性鉀通道在硫化氫對(duì)抗高糖損傷成骨細(xì)胞中的作用.pdf

1、背景及目的：
　　糖尿病性骨病在頜骨有骨量減少和骨質(zhì)疏松的表現(xiàn)，需要接受正畸治療的糖尿病患者中，Ⅰ型糖尿病青少年患者常因咬合問(wèn)題和頜骨發(fā)育異常就診，Ⅱ型糖尿病成人患者常因牙周退化和咬合問(wèn)題就診。正畸治療的成功在很大程度上取決于骨的改建能力，正畸力產(chǎn)生的組織反應(yīng)不僅與牙周、頜骨局部因素有關(guān)，也與影響骨代謝的全身因素、激素和細(xì)胞因子有關(guān)。如何防止糖尿病患者正畸治療中的骨喪失，促進(jìn)骨修復(fù)重建一直受到口腔正畸學(xué)者的關(guān)注。
　　糖尿病

2、導(dǎo)致骨代謝異常的機(jī)制尚未完全闡明，目前的研究認(rèn)為骨代謝異常的中心環(huán)節(jié)是成骨細(xì)胞(Osteoblast，OB)功能障礙，高糖（high glucose，HG）可直接抑制OB功能，骨形成受到抑制，鈣和維生素D代謝紊亂影響骨轉(zhuǎn)換水平，進(jìn)而導(dǎo)致骨礦化障礙引起骨代謝異常。應(yīng)用合適的藥物防止高糖對(duì)OB功能的損傷，是治療與骨代謝相關(guān)疾病的迫切需要。
　　硫化氫（hydrogen sulfide，H2S）是一種新型的氣體信號(hào)分子和細(xì)胞保護(hù)劑，是繼

3、一氧化氮和一氧化碳之后的第三種內(nèi)源性氣體信號(hào)分子?，F(xiàn)已證明OB(Osteoblast，OB)中存在內(nèi)源性H2S，生理濃度的增加可促進(jìn)OB分化，在骨折愈合過(guò)程中，H2S可以降低局部炎性細(xì)胞浸潤(rùn)并抑制OB中的氧化應(yīng)激反應(yīng)的作用，促進(jìn)骨折的愈合。內(nèi)源性H2S在牙周韌帶細(xì)胞(Periodontal ligament cell，PDL)和人牙周膜干細(xì)胞(Human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs)中

4、也有表達(dá)，參與正畸力力學(xué)信號(hào)的傳導(dǎo)，有助于牙周干細(xì)胞的成骨分化，對(duì)牙周組織和正畸牙齒移動(dòng)中軟硬組織的改建發(fā)揮重要作用。有學(xué)者進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，H2S異常代謝與骨代謝缺陷有關(guān)，提示如果能在動(dòng)物體內(nèi)提供有效無(wú)毒的H2S供體，有可能治療因H2S缺乏而引起的骨質(zhì)疏松癥等疾病。機(jī)體各個(gè)系統(tǒng)及組織中內(nèi)源性H2S的產(chǎn)生的作用及生理病理機(jī)制正在不斷揭示，隨著對(duì)外源性H2S的合成、供體的研究不斷深入，H2S有著廣闊的治療性應(yīng)用前景，使用外源性H2S或其供體

5、，在控制一些疾病的發(fā)生及發(fā)展方面正在發(fā)揮其積極的作用。
　　ATP敏感鉀離子通道(ATP-sensitive potassiumchannel，KATP)是最早報(bào)道的H2S生物學(xué)效應(yīng)靶分子，H2S能通過(guò)與心肌細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、胰腺β細(xì)胞、腸胃平滑肌細(xì)胞、神經(jīng)元上的KATP作用，產(chǎn)生調(diào)節(jié)心肌收縮力、血管緊張度、胰島素分泌、腸胃平滑肌收縮、神經(jīng)遞質(zhì)傳遞等效應(yīng)，并且H2S還能通過(guò)KATP產(chǎn)生抗炎、抗凋亡等細(xì)胞保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn)KAT

6、P與機(jī)體骨的形成密切相關(guān)，KATP影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的成骨分化，調(diào)節(jié)OB的增殖，作為離子通道，KATP維持骨細(xì)胞的膜電位并可能參與骨細(xì)胞的機(jī)械敏感性及細(xì)胞間通訊。非興奮細(xì)胞OB也存在KATP通道，但外源性H2S是否通過(guò)效應(yīng)分子KATP通道影響OB的功能目前尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　本實(shí)驗(yàn)以培養(yǎng)大鼠下頜骨原代成骨細(xì)胞(Primary osteoblast，POB)為研究對(duì)象，應(yīng)用分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)，首先檢測(cè)外源性H2

7、S是否通過(guò)其效應(yīng)分子KATP參與調(diào)節(jié)HG誘導(dǎo)的OB損傷，其次檢測(cè)外源性H2S通過(guò)KATP通道對(duì)高糖誘導(dǎo)的OB功能的影響，包括細(xì)胞增殖、凋亡、礦化的分析和成骨分化相關(guān)信號(hào)分子ALP、collaⅠ、Runx2及OSX基因的表達(dá)，本研究目的在于觀察外源性H2S-KATP通道對(duì)OB分化過(guò)程中的表達(dá)變化及功能的影響，進(jìn)一步探求KATP在OB分化中的作用，并初步研究分析其作用機(jī)制，尋找能調(diào)控或干擾OB功能、加速受損OB修復(fù)的新方法，以期為外源性H2

8、S促進(jìn)糖尿病患者骨的修復(fù)重建提供一定的理論基礎(chǔ)，為骨代謝病的防治提供新線索和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1、大鼠下頜骨POB的分離培養(yǎng)及鑒定
　　在無(wú)菌條件下，取出大鼠乳鼠的下頜骨，采用酶消化法-組織塊法聯(lián)合培養(yǎng)，從骨片中獲取原代細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶后傳代。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，并利用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，繪制生長(zhǎng)曲線。用堿性磷酸酶鈣鈷法和茜素紅染色法對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行OB生化特性鑒定。
　　2、觀察硫化氫

9、及高糖干預(yù)后OB的KATP通道的表達(dá)變化
　　選擇3-5代生長(zhǎng)旺盛，性質(zhì)穩(wěn)定的成骨細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)分組(1)對(duì)照(control)組:DMEM培養(yǎng)基(5.5mmol·L-1DMEM)處理OB，30min;(2)高糖(HG)組:HG(26.5mmol·L-1DMEM)處理OB30min;(3)硫化氫鈉(NaHS，為H2S的供體)組:NaHS(400μmol·L-1)處理成骨細(xì)胞30min，撤去，PBS洗2次，接著DMEM培

10、養(yǎng)基處理30min;(4)NaHS+HG組:NaHS作用OB30min，撤去，PBS洗2次，接著用HG處理30min;提取總蛋白和RNA，采用定量Western Blot和RT-PCR方法測(cè)定KATP的蛋白及基因的表達(dá)。
　　3、檢測(cè)硫化氫及KATP通道在高糖介導(dǎo)下對(duì)OB的增殖、凋亡、礦化及成骨分化相關(guān)信號(hào)分子的表達(dá)變化
　　選擇3-5代生長(zhǎng)旺盛，性質(zhì)穩(wěn)定的成骨細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)分組(1)control;(2)HG;

11、(3)NaHS;(4)NaHS+HG;(5)格列本脲(KATP通道阻斷劑glibenclamide，Gli)組:Gli(0.01μmol·L-1)作用成骨細(xì)胞30min，撤去，PBS洗2次，接著DMEM培養(yǎng)基處理30min;(6)Gli+NaHS+HG組:Gli作用成骨細(xì)胞30min，撤去，PBS洗2次，后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟與第(4)實(shí)驗(yàn)組相同;(7)吡拉地爾(KATP通道開(kāi)放劑pinacidil，Pin)組:Pin(0.1μmol·L-1)作

12、用成骨細(xì)胞30min，撤去，PBS洗2次，接著DMEM培養(yǎng)基處理30min;(8)Pin+HG組:Pin作用成骨細(xì)胞30min，撤去，PBS洗2次，接著HG處理30min;(9)Pin+NaHS+HG:Pin作用成骨細(xì)胞30min，撤去，PBS洗2次，后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟與第(4)實(shí)驗(yàn)組相同;分別用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡，CCK8及EDU方法檢測(cè)細(xì)胞增殖，茜素紅染色分析檢測(cè)細(xì)胞礦化，并用RT-PCR的方法檢測(cè)成骨分化相關(guān)信號(hào)分子堿性磷酸酶(A

13、lkaline phosphatase，ALP)，骨橋蛋白(osteopotin，OPN)，Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(runt-related transcript factor2，Runx2)，成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子(osterix，OSX)的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　1、成功分離、培養(yǎng)、鑒定POB。鏡下觀察，細(xì)胞呈三角形、紡錘形和多角形等多種形態(tài)，傳代培養(yǎng)成骨細(xì)胞狀態(tài)良好，細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底時(shí)，呈梭形或立方形，排列緊密。從細(xì)胞

14、生長(zhǎng)曲線觀察，第2-3天開(kāi)始快速生長(zhǎng)，第7-8天達(dá)生長(zhǎng)高峰，數(shù)目達(dá)到峰值后增長(zhǎng)速度逐漸減慢，進(jìn)入平臺(tái)期細(xì)胞數(shù)量開(kāi)始下降，細(xì)胞停止增殖并出現(xiàn)細(xì)胞調(diào)亡。經(jīng)堿性磷酸酶鈣鈷法染色和茜素紅染色鑒定陽(yáng)性，細(xì)胞具有OB的特性。
　　2、H2S減弱HG對(duì)OB的KATP通道蛋白及基因的抑制作用。免疫印跡分析表明，KATP表達(dá)在HG組有明顯的抑制作用，NaHS+HG組KATP表達(dá)明顯高于HG組(P＜0.01)，KATP通道蛋白的表達(dá)量在HG影響下減少

15、，而NaHS減弱HG對(duì)KATP的表達(dá)抑制。RT-PCR結(jié)果說(shuō)明，KATP基因的表達(dá)量在HG影響下明顯減少，而NaHS減弱HG對(duì)KATP基因的表達(dá)抑制。
　　3、H2S通過(guò)KATP通道調(diào)節(jié)HG抑制的OB增殖，凋亡。HG對(duì)OB增殖具有明顯的抑制作用，KATP阻斷劑Gli對(duì)OB增殖的抑制作用與HG對(duì)OB的增殖抑制作用類似，NaHS與KATP通道開(kāi)放劑Pin的作用類似，對(duì)OB的增殖增加比較明顯，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。當(dāng)用Gli

16、阻斷KATP通道，凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著增加(P＜0.01)，而KATP開(kāi)放劑Pin對(duì)細(xì)胞凋亡的影響與control相比無(wú)明顯影響，在NaHS和Pin加入后與HG相比，細(xì)胞凋亡明顯減少，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　4、H2S通過(guò)KATP調(diào)節(jié)OB分化及骨形成相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化;H2S對(duì)HG誘導(dǎo)的OB礦化減少有抑制作用，但抑制作用與KATP通道無(wú)關(guān)。HG明顯抑制OB的ALP、OPN，Runx2和OSX基因表達(dá)(P

17、＜0.01)。用NaHS處理，ALP的增強(qiáng)不明顯，但OPN，Runx2和OSX的表達(dá)與control相比明顯增強(qiáng)，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。HG對(duì)Runx2、OSX的抑制作用被NaHS明顯減弱(P＜0.01)，導(dǎo)致OB分化及骨形成相關(guān)基因表達(dá)增加。HG處理后的OB礦化量明顯降低(P＜0.01)，同時(shí)NaHS預(yù)處理對(duì)HG導(dǎo)致的OB礦化減少有抑制作用NaHS預(yù)處理能增加OB的礦化量，然而，Gli或Pin對(duì)OB礦化的與contal相比