尼古丁調(diào)控miR-30a生成影響牙周膜細胞細胞周期和炎性反應機制研究.pdf

1、牙周炎（periodontitis）作為口腔健康的頭號殺手，主要由菌斑引起的直接細胞毒作用及宿主對菌斑微生物的免疫應答導致牙周組織損傷，進一步引起牙周支持組織喪失，導致牙齒缺失。越來越多的研究證實在牙周炎發(fā)生發(fā)展過程中存在多種miRNAs的表達變化，提示它們在牙周炎發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。然而，其究竟通過何種途徑來影響牙周炎的發(fā)生發(fā)展過程，尚需大量研究證實。
　　吸煙作為牙周炎重要的危險因素，煙草中的主要成分尼古丁在牙周炎發(fā)生

2、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。課題組前期研究通過構(gòu)建牙周炎大鼠模型、體外培養(yǎng)人牙周膜細胞，尼古丁作用于實驗性牙周炎大鼠和人牙周膜細胞后，發(fā)現(xiàn)煙堿型乙酰膽堿受體α7亞型(alpha7 nicotinic acetylcholine receptor,α7 nAChR)在實驗性牙周炎大鼠牙周組織和和人牙周膜細胞的表達均顯著升高，α7 nAChR特異性拮抗劑α-銀環(huán)蛇毒素(α-bungarotoxin,α-BTX)可拮抗該效應，進而參與吸煙相關(guān)性

3、牙周炎發(fā)生發(fā)展過程。另有研究表明，尼古丁、α7 nAChR可能通過調(diào)控多種miRNAs表達水平，參與多種心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展過程。然而關(guān)于尼古丁、α7 nAChR調(diào)控 miRNAs參與牙周疾病乃至口腔疾病發(fā)生發(fā)展的研究卻鮮有報道。由此，我們猜想：尼古丁激活人牙周膜細胞α7 nAChR后可能會通過miRNAs進一步參與吸煙促牙周組織炎性損傷和抑制牙周組織修復過程。但是其具體分子機制尚需進一步研究。本研究將深入探討 miRNA

4、s在吸煙相關(guān)性牙周炎發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的作用，為牙周炎的防治提供新的理論依據(jù)和治療靶點。
　　目的：
　　本課題擬從尼古丁調(diào)控牙周膜細胞周期進程、細胞增殖、STAT3信號通路等方面入手，系統(tǒng)探討尼古丁可能通過調(diào)控牙周膜細胞miR-30a表達水平，進而調(diào)節(jié)NF-κB-miR-30a-STAT3反饋環(huán)路和CCNE2參與牙周組織炎性損傷和組織修復過程的機制；探索基于miR-30a調(diào)節(jié)途徑出發(fā)降低尼古丁促牙周炎患者的牙周組織損傷和抑制牙

5、周組織修復效應，為有效預防及治療吸煙相關(guān)性牙周炎提供新的理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.組織塊法進行牙周膜細胞原代培養(yǎng)；在成功培養(yǎng)原代牙周膜細胞后進行常規(guī)傳代。流式細胞實驗鑒定細胞表型；待牙周膜細胞傳至第五代時，給予細胞尼古丁處理，microRNA芯片檢測尼古丁處理后牙周膜細胞miRNAs表達情況，選取與細胞增殖和炎性反應密切相關(guān)的miRNAs進行qPCR驗證，考慮到miR-30家族成員成熟形式差異較小，故通過擴增其前體形式

6、來比較表達差異。
　　2.分別給予第5代牙周膜細胞10-5M尼古丁和/或10-8Mα-BTX和/或 miR-30a inhibitor處理；MTT實驗檢測各組細胞增殖情況，流式細胞實驗分析各組細胞周期分布情況，實時定量PCR檢測各組牙周膜細胞miR-30a表達情況，實時定量PCR和Western blot實驗檢測各組細胞CCNE2的mRNA和蛋白表達情況。構(gòu)建CCNE23’UTR野生型和突變型報告基因載體，雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌?/p>

7、證miR-30a是否可以直接結(jié)合 CCNE23’UTR區(qū)；設計 CCNE2干擾 RNA，驗證CCNE2在調(diào)節(jié)牙周膜細胞增殖和細胞周期中的作用。
　　3.分別給予第5代牙周膜細胞10-5M尼古丁和/或10-8Mα-BTX和/或 miR-30a inhibitor處理；采用實時定量PCR和Western blot實驗檢測各組細胞SOCS3、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、IL-1β、IL-6及TNF-α等炎性因子m

8、RNA和蛋白表達情況，雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測尼古丁對STAT3活性水平的影響。構(gòu)建SOCS33’UTR野生型和突變型報告基因載體，雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-30a是否可以直接結(jié)合SOCS33’UTR區(qū)；設計SOCS3干擾RNA，驗證SOCS3在調(diào)節(jié)牙周膜細胞JAK2-STAT3信號通路中的作用。
　　4.尼古丁可顯著上調(diào)pre-miR-30a表達，提示尼古丁對miR-30a的抑制作用可能發(fā)生于轉(zhuǎn)錄起始水平。因而，我們對

9、miR-30a的潛在宿主基因進行分析，發(fā)現(xiàn)miR-30a宿主基因的啟動子區(qū)存在轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的結(jié)合位點。分別給予第5代牙周膜細胞10-5M尼古丁和/或拮抗劑10-8Mα-BTX和/或5x10-5M PDTC和/或10-6M Cucurbitacin I處理；采用實時定量PCR檢測各組細胞miR-30a表達水平，Western blot實驗和雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測各組細胞NF-κB p65蛋白表達水平和NF-κB活性水平。

10、　　結(jié)果：
　　1.體外成功進行人牙周膜細胞原代培養(yǎng)。待細胞聚合生長至90％時，常規(guī)進行細胞傳代，流式細胞實驗發(fā)現(xiàn)細胞表面高表達間充質(zhì)細胞表型 CD29、CD105，低表達細胞表型CD31、CD14，提示細胞來源于間充質(zhì)；給予第5代牙周膜細胞尼古丁作用后進行 microRNA芯片檢測，發(fā)現(xiàn)有20個 microRNAs上調(diào)；16個microRNAs下調(diào)；選擇與炎性反應和細胞增殖密切相關(guān)的miR-30a、let-7f、miR-21及

11、let-7e進行實時定量 PCR驗證，發(fā)現(xiàn)10-5M尼古丁可顯著上調(diào)牙周膜細胞pre-miR-30a表達水平，且呈時間依賴性；而let-7f、miR-21及l(fā)et-7e表達水平無明顯規(guī)律，故最終確定miR-30a進行深入研究。
　　2.尼古丁可抑制牙周膜細胞增殖能力，轉(zhuǎn)染miR-30a inhibitor可逆轉(zhuǎn)尼古丁對牙周膜細胞增殖能力的抑制效應，差異有統(tǒng)計學意義；另外，尼古丁可抑制牙周膜細胞周期蛋白CCNE2表達，誘導牙周膜細胞

12、發(fā)生G1期阻滯，導致其合成DNA能力下降，進而影響其增殖過程。給予人牙周膜細胞轉(zhuǎn)染miR-30a inhibitor可干擾牙周膜細胞內(nèi)miR-30a的表達；進一步研究發(fā)現(xiàn)，抑制miR-30a的表達可調(diào)節(jié)尼古丁影響的牙周膜細胞CCNE2表達水平，削弱尼古丁抑制的牙周膜細胞周期進程；雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實miR-30a可直接結(jié)合CCNE23’UTR區(qū)，調(diào)控其表達水平；干擾CCNE2表達后，發(fā)現(xiàn)CCNE2是調(diào)控牙周膜細胞G1期向S期轉(zhuǎn)化的

13、關(guān)鍵因子，進而影響其增殖能力。
　　3.尼古丁可激活牙周膜細胞JAK2-STAT3信號通路，參與牙周組織炎性反應過程，表現(xiàn)為：尼古丁可明顯上調(diào)磷酸化的JAK2和STAT3蛋白表達水平和STAT3活性水平。對STAT3抑制劑Cucurbitacin I進行濃度梯度實驗發(fā)現(xiàn)，10-5M和10-6MCucurbitacin I均可抑制磷酸化STAT3蛋白表達水平，而10-5M Cucurbitacin I細胞毒性較大，細胞壞死較多，而1

14、0-7M Cucurbitacin I抑制STAT3能力較低，故選擇10-6M Cucurbitacin I作為后續(xù)的實驗濃度。另外，尼古丁激活JAK2-STAT3信號通路后，還可上調(diào)下游炎性因子IL-1β、IL-6及TNF-α表達水平，10-6M Cucurbitacin I可拮抗尼古丁的激活效應，提示尼古丁可通過JAK2-STAT3參與吸煙相關(guān)性牙周炎炎性損傷過程。進一步研究發(fā)現(xiàn)，抑制miR-30a的表達可調(diào)節(jié)尼古丁對JAK2-ST

15、AT3信號通路的激活效應，削弱尼古丁誘導的牙周組織炎性反應過程；雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實miR-30a可直接結(jié)合SOCS33’UTR區(qū)，調(diào)控其表達水平；干擾SOCS3表達后，發(fā)現(xiàn)SOCS3是調(diào)控牙周膜細胞JAK2-STAT3信號通路激活與否的關(guān)鍵因子。
　　4. Western blot和雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實尼古丁可激活牙周膜細胞NF-κB信號通路；另外，對miR-30a宿主基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游5000bp至下游1000b

16、p的DNA區(qū)域的分析表明，在該區(qū)域里存在NF-κB結(jié)合位點；當PDTC抑制NF-κB表達后，miR-30a的表達水平也受到抑制，提示NF-κB可能通過調(diào)控miR-30a的啟動子區(qū)影響其表達水平。而STAT3信號通路抑制劑Cucurbitacin I也能下調(diào)p65蛋白表達和NF-κB活性水平，進而構(gòu)成NF-κB-miR-30a-STAT3反饋環(huán)路參與牙周組織炎性損傷過程。
　　結(jié)論：
　　1.成功培養(yǎng)鑒定人牙周膜細胞，micr

17、oRNA芯片和實時定量PCR實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)尼古丁可能通過上調(diào)miR-30a表達水平參與吸煙相關(guān)性牙周炎發(fā)生發(fā)展過程。
　　2.尼古丁可通過上調(diào)人牙周膜細胞miR-30a表達水平，來靶向下調(diào)CCNE2表達水平，促進牙周膜細胞發(fā)生G1期阻滯，進而抑制牙周膜細胞增殖能力，參與吸煙抑制牙周組織修復過程。
　　3.尼古丁通過上調(diào)人牙周膜細胞miR-30a表達水平，來靶向下調(diào)SOCS3表達水平，解除其對牙周膜細胞STAT3信號通路的抑制作