干擾素-β修飾的人牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞對舌鱗狀細(xì)胞癌的抑制作用.pdf

1、目的:
　　本課題旨通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)探討IFN-β修飾的人GMSCs對TSCC的生物學(xué)效應(yīng)及作用機(jī)制，為臨床治療TSCC提供新思路。本實(shí)驗(yàn)分離培養(yǎng)人GMSCs，構(gòu)建表達(dá)IFN-β的慢病毒載體及空載載體，分別轉(zhuǎn)染人GMSCs得到GMSCs/IFN-β、GMSCs/vector，檢測GMSCs、GMSCs/vector、GMSCs/IFN-β及IFN-β在體外對TSCC細(xì)胞生物學(xué)活性的影響，并探討其作用機(jī)制;使用裸鼠TSCC移植瘤模型來

2、檢測GMSCs/IFN-β是否能夠選擇性的遷移至腫瘤組織內(nèi)，并作為IFN-β釋放的載體發(fā)揮抑制TSCC生長的效應(yīng)。
　　材料與方法:
　　1.有限稀釋法克隆培養(yǎng)人GMSCs及其多向分化能力的檢測
　　牙齦標(biāo)本取自進(jìn)行牙冠延長術(shù)的健康牙齦組織，通過有限稀釋法分離培養(yǎng)人GMSCs，并檢測人GMSCs克隆形成能力、群體倍增值，流式細(xì)胞儀檢測其細(xì)胞表面干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)。為檢測人GMSCs向成骨方向分化的能力，將GMSCs分別

3、接種于6孔板和24孔板中，加入成骨誘導(dǎo)液進(jìn)行培養(yǎng)，基礎(chǔ)培養(yǎng)液為含10％胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的細(xì)胞培養(yǎng)液(Dulbecco's Modified Eagle's Medium，DMEM)，誘導(dǎo)劑為50mg/L的維生素C、0.1μmol/L的地塞米松、10mmol/L的β-磷酸甘油鈉，培養(yǎng)28天(days，d)以后，在24孔板中進(jìn)行茜素紅染液染色。
　　2.IFN-β修飾的人GMSCs構(gòu)建
　

4、　構(gòu)建帶有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)標(biāo)記的表達(dá)IFN-β的慢病毒載體(Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin-IFN-β)及空載體病毒(Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin)，分別轉(zhuǎn)染人GMSCs得到GMSCs/IFN-β及GMSCs/vector，為檢測攜帶IFN-β基因慢病毒的轉(zhuǎn)染效

5、率，轉(zhuǎn)染一周后，通過qRT-PCR檢測GMSCs/IFN-β及GMSCs/vector中IFN-β在mRNA水平的表達(dá);并收集轉(zhuǎn)染一周后的條件培養(yǎng)基(Condition medium,CM)，通過酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測CM中IFN-β蛋白的表達(dá)水平。
　　3.GMSCs、GMSCs/vector、GMSCs/IFN-β及IFN-β對TSCC細(xì)胞的體外生

6、物學(xué)效應(yīng)
　　3.1.CM的收集
　　使用CM來檢測GMSCs、GMSCs/vector及GMSCs/IFN-β對TSCC細(xì)胞系Cal27細(xì)胞生物學(xué)活性的影響。GMSCs、GMSCs/vector及GMSCs/IFN-β以新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時(shí)(hours，h)后，收集培養(yǎng)液作為CM，基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為空白對照組（含10％FBS的DMEM），含750pg/ml IFN-β的基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為陽性對照組。
　　3.2.CCK-8

7、(Cell counting kit-8)法檢測細(xì)胞增殖
　　TSCC細(xì)胞系Cal27細(xì)胞以1×103每孔的密度接入96孔板，接種細(xì)胞24h后按照設(shè)計(jì)的組別加入刺激，每天更換新鮮的刺激，于設(shè)計(jì)好的時(shí)間點(diǎn)每孔內(nèi)加入100μl含10μl CCK-8的DMEM，培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫孵育2h后，使用酶標(biāo)儀檢測450nm處OD值。
　　3.3.克隆形成實(shí)驗(yàn)
　　Cal27細(xì)胞以1×103每孔的密度接入6孔板，接種細(xì)胞24h后按照設(shè)計(jì)的組

8、別加入刺激，每天更換新鮮的刺激，7d后采用結(jié)晶紫染色法染色，40倍鏡下計(jì)數(shù)形成克隆的數(shù)量，大于或等于50個(gè)細(xì)胞算一個(gè)克隆。
　　結(jié)果:
　　1.分離培養(yǎng)的人GMSCs的生物學(xué)活性
　　原代培養(yǎng)的人牙齦細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞的形態(tài)特征，通過有限稀釋法分離培養(yǎng)人GMSCs，經(jīng)過14d培養(yǎng)后，通過克隆計(jì)數(shù)計(jì)算，人GMSCs的克隆形成率(colony forming unit-fibroblastic，CFU-F)為（21.4士2.

9、8）％;人GMSCs傳至12代時(shí)仍能表現(xiàn)出較高的生長活性，其群體倍增值為40.95士4.19;通過流式細(xì)胞儀檢測，人GMSCs表達(dá)間充質(zhì)源性干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD44、CD73、CD90、CD105、CD166和Stro-1，不表達(dá)造血源性干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD14、CD34、CD45;人GMSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)劑培養(yǎng)28d后，茜素紅鈣鹽染色顯示誘導(dǎo)組人GMSCs形成紅色的礦化結(jié)節(jié);人GMSCs經(jīng)成脂誘導(dǎo)劑培養(yǎng)28d后，油紅O染色顯示誘導(dǎo)組人G

10、MSCs細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)密集紅染的脂肪小滴;經(jīng)成軟骨誘導(dǎo)劑培養(yǎng)28d后，免疫組織化學(xué)染色顯示誘導(dǎo)組人GMSCs細(xì)胞團(tuán)Ⅱ型膠原染色陽性;在qRT-PCR實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)過誘導(dǎo)的GMSCs組成骨相關(guān)基因（RUNX2、OPN和BSP2）、成脂相關(guān)基因(leptin、adipsin和PPARγ2)和成軟骨相關(guān)基因（aggrecan、COL-Ⅱ和SOX9）mRNA表達(dá)水平顯著高于未加誘導(dǎo)劑的正常對照組。
　　2.構(gòu)建的GMSCs/IFN-β能夠穩(wěn)定表達(dá)

11、分泌IFN-β
　　攜帶IFN-β的慢病毒及空載體病毒轉(zhuǎn)染人GMSCs后，人GMSCs形態(tài)未發(fā)生明顯變化，細(xì)胞呈長梭形，有成纖維細(xì)胞的形態(tài)特征;轉(zhuǎn)染慢病毒48h后熒光顯微鏡下觀察，GMSCs/vector組與GMSCs/IFN-β組均有較強(qiáng)的熒光表達(dá);QRT-PCR結(jié)果顯示GMSCs/IFN-β組IFN-βmRNA表達(dá)量顯著高于GMSCs、GMSCs/vector組（P＜0.01）;ELISA結(jié)果顯示GMSCs/IFN-β組IFN

12、-β分泌量為756.7±19.91pg/ml，顯著高于GMSCs、GMSCs/vector組（P＜0.01），表明GMSCs/IFN-β分泌的IFN-β蛋白水平與mRNA水平一致，而GMSCs與GMSCs/vector兩組間IFN-β的表達(dá)無明顯差異，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)GMSC/IFN-β能夠穩(wěn)定的表達(dá)分泌IFN-β。
　　3.GMSCs、GMSCs/vector、GMSCs/IFN-β及IFN-β在體外顯著抑制Cal27細(xì)胞的生長增殖

13、
　　CCK8結(jié)果顯示，與空白對照組相比，培養(yǎng)2d后，各實(shí)驗(yàn)組Cal27細(xì)胞生長增殖明顯減慢(P＜0.01）;而GMSCs/vector組與GMSCs組相比，Cal27細(xì)胞生長活性無顯著性差異;GMSCs/IFN-β組、IFN-β組，與GMSCs、GMSCs/vector組相比，表現(xiàn)出更顯著的抑制Cal27細(xì)胞生長的效應(yīng)(P＜0.01）;GMSCs/IFN-β組與IFN-β組對Cal27細(xì)胞生長增殖的抑制效應(yīng)無明顯差異?？寺⌒纬蓪?shí)

14、驗(yàn)得到類似的結(jié)果，與空白對照組相比，各實(shí)驗(yàn)組形成的克隆數(shù)目顯著減少(P＜0.01）;而與GMSCs組相比，GMSCs/vector組Cal27細(xì)胞克隆形成數(shù)目無顯著性差異;與GMSCs組、GMSCs/vector組相比，GMSCs/IFN-β及IFN-β表現(xiàn)出更顯著的抑制Cal27細(xì)胞克隆形成能力的效應(yīng)(P＜0.01);GMSCs/IFN-β組與IFN-β組Cal27細(xì)胞克隆形成數(shù)目無明顯差異。為檢測GMSCs、GMSCs/vector

15、、GMSCs/IFN-β及IFN-β抑制Cal27細(xì)胞生長增殖的機(jī)制，使用流式細(xì)胞儀檢測各組對細(xì)胞周期及凋亡的影響，結(jié)果顯示，與空白對照組相比，各實(shí)驗(yàn)組對Cal27細(xì)胞的細(xì)胞周期無顯著影響，各組Cal27細(xì)胞中S期細(xì)胞的所占的比例統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;與空白對照組相比，各實(shí)驗(yàn)組均顯著促進(jìn)Cal27細(xì)胞凋亡（P＜0.01）;與GMSCs組、GMSCs/vector組相比，GMSCs/IFN-β及IFN-β表現(xiàn)出更顯著的促進(jìn)Cal27細(xì)胞凋亡的效應(yīng)(

16、P＜0.01)，結(jié)果證實(shí)GMSCs/IFN-β在體外顯著抑制Cal27細(xì)胞的生長增殖并促進(jìn)其凋亡。Western blotting結(jié)果顯示，GMSCs/IFN-β作用后，Cal27細(xì)胞中AKT的磷酸化水平顯著下降，提示GMSCs/IFN-β抑制Cal27細(xì)胞的生長增殖，可能與AKT信號通路的下調(diào)有關(guān)。
　　結(jié)論:
　　1.通過有限稀釋法成功從人牙齦組織中分離培養(yǎng)出GMSCs。
　　2.成功構(gòu)建IFN-β修飾的人GMSC

17、s(GMSCs/IFN-β)，GMSCs/IFN-β能穩(wěn)定表達(dá)分泌IFN-β。
　　3.人GMSCs能夠抑制TSCC細(xì)胞系Cal27細(xì)胞的生長增殖、遷移及侵襲，促進(jìn)其凋亡，反映出GMSCs作為IFN-β釋放載體對TSCC治療的有效性和安全性。
　　4.與GMSCs相比，GMSCs/IFN-β能夠更顯著地抑制TSCC細(xì)胞生長增殖、促進(jìn)凋亡、抑制其侵襲和遷移，Western blotting結(jié)果提示GMSCs/IFN-β抑制Ca

18、l27細(xì)胞的生長增殖效應(yīng)，可能與AKT信號通路的下調(diào)有關(guān)。
　　5.尾靜脈注射的GMSCs、GMSCs/vector及GMSCs/IFN-β能夠向裸鼠TSCC移植瘤組織遷移并在體內(nèi)抑制腫瘤組織的生長，GMSCs/IFN-β(i.v.)顯示出比其他各組更為顯著的抑制腫瘤生長的效應(yīng)，結(jié)果提示GMSCs/IFN-β在腫瘤組織局部分泌釋放IFN-β可能發(fā)揮抑制TSCC生長的效應(yīng)，反映出GMSCs作為IFN-β釋放載體對TSCC治療安全有效