CPTⅡF352C突變對于重癥EV71感染的臨床和機制研究.pdf

1、本研究分為兩個部分：
　　第一部分：CPTⅡ F352C突變對重癥EV71感染的臨床研究
　　目的：研究肉堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶Ⅱ（CPTⅡ）基因多態(tài)性與EV71感染遺傳易感性的關(guān)系，探討CPTⅡ F352C突變及低血ATP水平對重癥EV71感染的影響。
　　方法：于2009年05月至2013年11月收集山東青島地區(qū)的EV71感染患兒333例，根據(jù)病情輕重分成EV71感染組、EV71腦炎組。提取患兒外周血白細(xì)胞的基因組DNA

2、，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)擴增EV71感染患兒及328例正常對照兒童CPTⅡI的5個外顯子，并利用haploview軟件識別該基因的所有單倍型，分析各個位點間的連鎖不平衡關(guān)系；同時檢測患者外周血ATP水平，記錄患兒的癥狀、體征、臨床特點及實驗室檢測指標(biāo)。
　　結(jié)果：EV71感染組患兒CPTⅡ F352C位點G等位基因頻率明顯高于正常對照組(26.9％VS20.4%，OR=1.432,95%CI=1.109-1.713，p=0.006)，且

3、該位點G等位基因頻率在EV71腦炎組與普通手足口病組相比，其差異也有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義(36.3%VS24.7%，OR=1.734,95%CI=1.145-2.626，P=0.009)。V368I位點基因頻率、等位基因分布在EV71感染組與對照組中無顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），但在EV71感染患兒中，EV71腦炎患兒V368I位點A等位基因頻率明顯高于普通手足口病患兒（17.7%VS27.7%，OR=0.564,95%CI=0.343

4、-0.927，P=0.023）。CPTⅡ F352C位點（TG+GG）基因型攜帶患兒ATP水平在重癥組(0.63±0.06mmol/L vs.0.69±0.08mmol/L，P＜0.01)和輕癥組(0.93±0.08 mmol/L vs.0.96±0.05mmol/L，P=0.025)中均有明顯下降，而且在EV71腦炎患兒中，A-G單倍型攜帶患兒其ATP水平較A-T單倍型(0.65±0.09 mmol/L vs.0.69±0.07 mm

5、ol/L，P＜0.01)及 G-T單倍型(0.65±0.09 mmol/L vs.0.69±0.05 mmol/L，P＜0.01)均有明顯下降；A-G單體型患兒ATP水平與持續(xù)發(fā)熱時間、CRP水平、白細(xì)胞計數(shù)及血糖濃度均呈顯著的負(fù)相關(guān)（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01），而與病毒載量沒有明顯的相關(guān)關(guān)系（P>0.05）。
　　結(jié)論：⑴CPTⅡ F352C突變與重癥EV71感染有關(guān)，G等位基因攜帶者EV71腦炎的

6、發(fā)病幾率明顯升高。⑵CPTⅡ A-G單倍型攜帶者與重癥EV71感染有關(guān)。⑶CPTⅡ F352C位點G等位基因攜帶者EV71感染后ATP產(chǎn)生減少，導(dǎo)致了線粒體能量代謝障礙，從而介導(dǎo)EV71感染重癥的發(fā)生發(fā)展。
　　第二部分：CPTⅡ F352C突變對CPTⅡ蛋白功能的影響
　　目的：研究EV71感染及不同溫度干預(yù)轉(zhuǎn)染細(xì)胞后CPTⅡ酶活性、脂肪酸β-氧化和ATP水平、線粒體膜電位，最終明確1055T>G/F352C突變對重癥EV

7、71腦炎患者CPTⅡ功能的影響。
　　方法：隨機選取3例EV71重癥腦炎患兒：經(jīng)CPTⅡ基因全外顯子測序，證實為CPTⅡ1055/F352C位點野生型（TT）1例及CPTⅡ1055/F352C位點變異型2（TG/GG各1例）例。擴增制備含有CPTⅡ F352C基因的片段，并與載體GV416進行重組，實現(xiàn)體外環(huán)化，獲得含有CPTⅡ F352C野生型和突變型基因的過表達(dá)慢病毒載體并共同轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，各組分為2部分，分別加入EV71

8、懸液和等量DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)72小時后，分別置于37℃、39℃和41℃情況下培養(yǎng)2小時，并立即利用不同濃度的L-Carnitine作為底物，測定CPTⅡ剩余酶的活性；同時經(jīng)熒光探針JC-1染色，以流式細(xì)胞儀檢測數(shù)據(jù)經(jīng)Cell Quest軟件采集，以二通道（FL2）與一通道（FL1）平均熒光強度的比值(FL2/FLl)檢測線粒體膜電位；用1％的三氯乙酸處理Vero細(xì)胞后，收集上清液，經(jīng)luminometer檢測相對光單位，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計

9、算ATP的濃度。
　　結(jié)果：CPTⅡ1055T>G/F352C位點GT、GG基因型攜帶者未經(jīng)EV71干預(yù)時，于41℃培養(yǎng)2小時后，其線粒體膜電位較37℃、39℃條件下明顯下降；而感染EV71后，線粒體膜電位在各培養(yǎng)溫度下均有明顯下降，且與溫度呈明顯的負(fù)相關(guān)；同時GT、GG基因型Vero細(xì)胞經(jīng)EV71干預(yù)后，其ATP水平較前下降，且在39℃、41℃培養(yǎng)溫度下，其ATP水平較37℃培養(yǎng)條件下有顯著下降，與培養(yǎng)溫度之間存在明顯的負(fù)相關(guān),