弓形蟲ROP16-GRA7復(fù)合DNA疫苗與基因佐劑B7-2對(duì)小鼠的免疫保護(hù)性研究.pdf

1、研究背景:剛地弓形蟲是一種廣泛寄生于人和動(dòng)物有核細(xì)胞內(nèi)的原蟲，可引起人獸共患弓形蟲病，嚴(yán)重威脅著人類健康和畜牧業(yè)生產(chǎn)。由于抗弓形蟲藥物不能達(dá)到理想的治療效果，研制安全有效的疫苗來預(yù)防和控制弓形蟲病成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。
　　研究目的:構(gòu)建編碼弓形蟲棒狀體蛋白R(shí)OP16和致密顆粒蛋白GRA7基因片段的DNA復(fù)合疫苗，以及能表達(dá)小鼠共刺激分子B7-2的重組質(zhì)粒作為分子佐劑，免疫接種昆明小鼠，評(píng)價(jià)疫苗的保護(hù)效果，以及分子佐劑的添加對(duì)疫苗誘

2、導(dǎo)的免疫應(yīng)答的影響，為優(yōu)化弓形蟲DNA疫苗免疫效果提供新思路。
　　研究方法:使用PCR技術(shù)分別擴(kuò)增弓形蟲抗原ROP16和GRA7基因以及小鼠共刺激分子B7-2基因，經(jīng)TA克隆回收各目的片段，在測(cè)序正確后，亞克隆至真核表達(dá)載體pEGFP-C1中，構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pEGFP-ROP16、pEGFP-GRA7、pEGFP-ROP16-GRA7和pEGFP-B7-2;經(jīng)PCR、雙酶切和測(cè)序鑒定后，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，熒光顯微

3、鏡觀察、SDS-PAGE和Westernblotting分析檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)情況;大量抽提重組質(zhì)粒用于制備弓形蟲DNA疫苗與基因佐劑B7-2，經(jīng)肌肉注射昆明小鼠，檢測(cè)分析接種前后小鼠細(xì)胞免疫與體液免疫指標(biāo)的變化;最后進(jìn)行攻擊感染實(shí)驗(yàn)，觀察小鼠生存時(shí)間，評(píng)價(jià)疫苗和佐劑的保護(hù)效果。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:構(gòu)建了重組真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-ROP16、pEGFP-ROP16-GRA7和pEGFP-B7-2，經(jīng)PCR、雙酶切和DNA測(cè)序鑒定正確

4、，各目的基因片段完整準(zhǔn)確連接到表達(dá)載體上。pEGFP-ROP16、pEGFP-GRA7、pEGFP-ROP16-GRA7和pEGFP-B7-2轉(zhuǎn)染的HEK293T細(xì)胞在熒光顯微鏡下觀察均可看到綠色熒光，抽提的蛋白經(jīng)SDS-PAGE和Westernblotting分析，均能檢測(cè)到目的蛋白。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，復(fù)合基因疫苗pEGFP-ROP16-GRA7組比單基因疫苗組和對(duì)照組誘導(dǎo)出更高水平的抗弓形蟲IgG、IgG2a、IFN-γ和CD8+/

5、CD4+，小鼠中位生存時(shí)間也有所延長(zhǎng);分子佐劑B7-2共免疫組與單用疫苗組相比上述指標(biāo)得到進(jìn)一步提高(P＜0.05);而各組間IgG1、IL-4和IL10水平無顯著性差異。
　　結(jié)論:弓形蟲棒狀體抗原ROP16基因與致密顆?？乖璆RA7基因均可誘導(dǎo)昆明小鼠特異性的抗弓形蟲體液免疫、Th1型和CD8+T細(xì)胞反應(yīng);ROP16和GRA7的復(fù)合基因疫苗比單一基因疫苗具有更強(qiáng)的保護(hù)性免疫;分子佐劑B7-2的使用有效增強(qiáng)了各抗原誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫