結(jié)核病人與健康成人外周血γδT細(xì)胞Vδ1-8亞群分布的差異.pdf

1、背景：結(jié)核病是嚴(yán)重危害人類健康的常見感染性疾病之一，但關(guān)于機(jī)體抗結(jié)核感染的免疫機(jī)制尚未完全闡明。以往研究認(rèn)為，αβT細(xì)胞中CD4+和CD8+T細(xì)胞，以及巨噬細(xì)胞在抗結(jié)核免疫中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。近年來很多研究結(jié)果證實(shí)γδT細(xì)胞在抗結(jié)核桿菌感染免疫中也發(fā)揮重要作用。γδT細(xì)胞是與αβT細(xì)胞有不同特征的獨(dú)特T細(xì)胞，許多研究表明γδT細(xì)胞在抗感染免疫、抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用，同時(shí)γδT細(xì)胞在調(diào)節(jié)特異性免疫應(yīng)答、自身免疫性疾病和變態(tài)反應(yīng)性疾病的發(fā)

2、生均有重要的參與作用。γδT細(xì)胞可產(chǎn)生多種細(xì)胞因子和趨化因子，在抗感染免疫，特別是在抗結(jié)核桿菌感染的早期免疫中可能發(fā)揮重要作用。γδT細(xì)胞根據(jù)δ鏈V區(qū)不同可分為8個(gè)亞群（Vδ1至Vδ8），正常人以為Vδ2亞群為主。有研究顯示，在某些疾病患者γδT細(xì)胞中Vδ1和Vδ2亞群的比例明顯改變。本研究室的前期研究中也觀察到同樣現(xiàn)象。我們關(guān)注的科學(xué)問題是：健康成年人與結(jié)核病人γδT細(xì)胞的Vδ1-8各亞群分布情況究竟是怎樣的，健康成年人與結(jié)核病人是否

3、有明顯差異？尤其是Vδ1亞群和Vδ2亞群。
　　目的：調(diào)查健康成人外周血中Vδ1-8各亞群的分布情況和結(jié)核病人外周血中Vδ1-8各亞群的分布改變，通過研究對(duì)比，探討γδT細(xì)胞Vδ1-8各亞群，特別是Vδ1亞群和Vδ2亞群在結(jié)核感染中可能發(fā)揮的不同作用。
　　方法：抽取一定數(shù)量健康成人和結(jié)核病人空腹靜脈血于肝素鈉抗凝管中備用，取試管與不完全1640培養(yǎng)液混勻，用人淋巴細(xì)胞分離液經(jīng)密度梯度離心法獲取外周血單個(gè)核細(xì)胞。用磷酸鹽緩沖

4、液洗滌后，調(diào)整細(xì)胞濃度5×106/ml－1×107/ml。
　　流式細(xì)胞儀檢測法取上述細(xì)胞懸液，分別加入抗人 CD3-FITC，抗人CD3-APC，抗人Vδ1-PE，抗人γδ-TC，抗人Vδ1-FITC，抗人Vδ2-PE表面染色后，用流式細(xì)胞儀檢測。數(shù)據(jù)分析采用Cell Quest軟件，計(jì)算Vδ1+，Vδ2+細(xì)胞以及Vδ1－/Vδ2－(即Vδ3～8+)細(xì)胞各自在γδT細(xì)胞中的百分比。
　　熒光定量RT－PCR檢測法取上述細(xì)胞

5、懸液用Trizol裂解后提取RNA并用超微量核酸蛋白檢測儀鑒定RNA質(zhì)量，合格者用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒按標(biāo)準(zhǔn)加樣后在PCR儀上逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，再將cDNA按標(biāo)準(zhǔn)加入SYBR Green Reagents熒光試劑，放入實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀反應(yīng)，反應(yīng)參照基因?yàn)楦视腿?3-磷酸脫氫酶。所得數(shù)據(jù)將δ1-8基因循環(huán)數(shù)與內(nèi)參的差值?經(jīng)過2-?換算后得到各基因相對(duì)表達(dá)量，并計(jì)算均

6、數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差。
　　結(jié)果：⑴36例健康成年人中，流式細(xì)胞儀檢測，大多數(shù)人γδT細(xì)胞δ2亞群所占比例最高；實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR法檢測 Vδ1-8基因，δ2基因相對(duì)表達(dá)量為0.0955±0.006，占總γδT細(xì)胞表達(dá)量的57.96％。其他基因按相對(duì)表達(dá)量由多到少排列，依次為δ3、δ1、δ7、δ8、δ4、δ5、δ6。⑵10例結(jié)核病人當(dāng)中，流式細(xì)胞儀檢測，大多數(shù)人γδT細(xì)胞主要以δ1亞群為主；實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法檢測δ1-8基因

7、，δ1基因相對(duì)表達(dá)量為0.01723±0.0001，占總γδT細(xì)胞表達(dá)量的46.60%。δ2基因相對(duì)表達(dá)量為0.0042±0.0007，僅占總γδT細(xì)胞表達(dá)量的11.44%。其他基因按相對(duì)表達(dá)量由多到少排列，依次為δ5、δ6、δ4、δ7、δ3、δ8。⑶統(tǒng)計(jì)學(xué)驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)，健康成年人組的Vδ1組，Vδ2組，Vδ1－/Vδ2－(即Vδ3-8+)組R2在0.941到0.985間，結(jié)核病人組的Vδ1組，Vδ2組，Vδ3-8組R2在0.967到0

8、.990間，(P<0.05)。
　　結(jié)論：①流式細(xì)胞術(shù)和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，36例健康成年人γδT細(xì)胞亞群中，以Vδ2亞群比例最高（占總γδT細(xì)胞57.96%），其他亞群的比例由多到少依次為δ3、δ1、δ7、δ8、δ4、δ5、δ6。②與健康成年人不同，10例結(jié)核病人的γδT細(xì)胞主要以δ1亞群為主（占總γδT細(xì)胞46.60%），其他亞群的比例由多到少依次為δ5、δ6、δ2、δ4、δ7、δ3、δ8。③流式細(xì)胞儀檢測法與實(shí)時(shí)定量