肺結(jié)核患者外周血Tγδ17細(xì)胞的亞群分析以及結(jié)核桿菌抗原對誘導(dǎo)Tγδ17細(xì)胞分化的影響.pdf

1、研究背景：在宿主對結(jié)核分枝桿菌（Mtb）感染的免疫機(jī)制中，γδT細(xì)胞的作用越來越受到關(guān)注和重視。近年研究報道Mtb和卡介苗感染的小鼠模型中分泌IL-17的細(xì)胞主要來源于γδT細(xì)胞。本研究室近期的研究也發(fā)現(xiàn)活動性肺結(jié)核（TB）患者外周血中產(chǎn)生IL-17的γδT細(xì)胞（Tγδ17細(xì)胞）的比例明顯高于正常健康人。但Tγδ17細(xì)胞是屬于γδT細(xì)胞的何種亞群，以及肺TB患者的Tγδ17細(xì)胞的亞群類別與健康人有何不同，均尚未見報道。另外，雖然對于誘導(dǎo)

2、Th17細(xì)胞分化的關(guān)鍵性細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子已經(jīng)明確，但是對于誘導(dǎo)Tγδ17細(xì)胞分化的細(xì)胞因子，轉(zhuǎn)錄因子和抗原的調(diào)節(jié)作用等影響因素的研究很少，尚有待探討闡明。
　　目的：檢測TB患者和健康人（HD）外周血中Tγδ17細(xì)胞屬于γδT細(xì)胞何種亞群（Vδ1、Vδ2及Vδ3-8亞群）探討肺TB患者的Tγδ17細(xì)胞的亞群類別與健康人有何不同,以及結(jié)核桿菌（M.tb）耐熱抗原（Mtb-HAg）、磷酸化抗原（HDMAPP）加入細(xì)胞因子誘導(dǎo)Tγδ1

3、7細(xì)胞分化有何不同，以探討不同淋巴細(xì)胞亞群在抗M.tb感染免疫應(yīng)答和TB發(fā)病機(jī)制中的作用。
　　方法：1.采集70例活動性肺結(jié)核病人、100例HD和33例矽肺患者外周血，加入熒光標(biāo)記單抗進(jìn)行表面分子染色，流式細(xì)胞儀檢測γδT細(xì)胞亞群（Vδ1、Vδ2及Vδ3-8亞群）的比例變化。2.采集24例活動性肺結(jié)核病人和17例HD外周血，加入佛波醇酯（PMA）和鈣離子霉素（Ionomycin）刺激培養(yǎng)2小時后，再加入莫能霉素（Monensin

4、）繼續(xù)培養(yǎng)4小時，收集細(xì)胞，加入熒光標(biāo)記單抗進(jìn)行表面分子和胞內(nèi)染色，流式細(xì)胞儀檢測產(chǎn)生Tγδ17細(xì)胞亞群（Vδ1、Vδ2及Vδ3-8亞群）比例及。3.采用密度梯度離心法分離外周血單個核細(xì)胞（PBMC），加入Mtb-Hag、HDMAPP和細(xì)胞因子（IL-1β、IL-23和TGF-β）培養(yǎng)3天后，加入rIL-2刺激培養(yǎng)9天后，使其成為富含效應(yīng)性γδT細(xì)胞的細(xì)胞群，收集細(xì)胞用PMA/Ionomycin和Monensin刺激培養(yǎng)6小時，用流式細(xì)

5、胞儀檢測Tγδ17細(xì)胞亞群的比例。
　　結(jié)果：
　　1、TB患者>60歲初治組（n＝16）γδT細(xì)胞在T細(xì)胞中的比例（5.26％）低于正常人>60歲組（n＝23）的比例（6.3%），TB患者<60歲復(fù)治組（n＝16）γδT細(xì)胞在T細(xì)胞中的絕對值（74.52%）低于TB患者<60歲初治組<60歲組（n＝34）的絕對值（144.69）（絕對值單位為101/μl）。
　　2、TB患者<60歲初治組（n＝32）復(fù)治組（n＝16

6、）的Vδ2+亞群在總γδ T細(xì)胞中比例（60.06%和48.82%）明顯低于正常人<60歲組（n＝75）的比例（73.68%）（p均<0.01）。TB患者<60歲初治組（n＝32）復(fù)治組（n＝11）的Vδ1+亞群在總γδT細(xì)胞中比例（25.01%和22.61%）明顯高于正常人<60歲組（n＝75）的比例（11.82%）（p均<0.05）。TB患者>60歲復(fù)治組（n＝14）的Vδ3-8+亞群在總γδ T細(xì)胞中比例（33.17%）明顯高于正

7、常人>60歲組（n＝21）的比例（14.49%）（p<0.05）。TB患者>60歲初治組（n＝14）的Vδ1+亞群在總γδT細(xì)胞中的絕對值（3.71）明顯低于TB患者>60歲復(fù)治組（n＝10）的絕對值（11.71）。TB患者>60歲初治組（n＝14）的Vδ3-8+亞群在總γδT細(xì)胞中的絕對值（3.03）明顯低于TB患者<60歲初治組（n＝32）的絕對值（14.89）（p均<0.05.單位為101/μl）。
　　3、結(jié)核病組Tγδ1

8、7細(xì)胞中以Vδ3-8亞群最多，其次為Vδ2亞群，最少為Vδ1亞群。正常組Tγδ17細(xì)胞以Vδ3-8亞群最多，其次為Vδ1亞群，最少為Vδ2亞群。其中正常組γδT細(xì)胞亞群:Vδ1亞群（n=14）、Vδ2亞群（n=18）和Vδ3-8亞群（n=14）的百分比分別為27.31%、10.52%和63.46%，而結(jié)核病組γδT細(xì)胞亞群:Vδ1亞群（n=23）、Vδ2亞群（n=24）和Vδ3-8亞群（n=23）的百分比分別為5.03%、10.52%和

9、75.03%。
　　4、從γδT細(xì)胞亞群的絕對值上進(jìn)行比較，正常組中產(chǎn)生Tγδ17細(xì)胞的亞群類別中Vδ1亞群與Vδ3-8亞群絕對值相當(dāng)，而結(jié)核病組產(chǎn)生Tγδ17細(xì)胞的亞群類別Vδ3-8亞群絕對值急劇升高。其中正常組γδT細(xì)胞亞群:Vδ1亞群（n=14）、Vδ2亞群（n=18）和Vδ3-8亞群（n=14）的絕對值分別為2.46、0.19和2.78，而結(jié)核病組γδ T細(xì)胞亞群:Vδ1亞群（n=23）、Vδ2亞群（n=24）和Vδ3-8

10、亞群（n=23）的絕對值分別為0.64、0.46和3.7。（單位為101/μl）
　　5、Mtb-Ag+CK組與HDMAPP+CK組在Tγδ17的比例比較中有明顯差異，前一組明顯比后組升高。Mtb-Ag+CK組與HDMAPP+CK組中Vδ2在Tγδ17所占比例比較中，前者較后者明顯降低。
　　結(jié)論：
　　1、在正常人中γδT細(xì)胞主要以Vδ2+亞群為主，而在初治結(jié)核病、復(fù)治結(jié)核病以及矽肺患者中，Vδ2+亞群比例降低，而V

11、δ1+亞群比例增高或Vδ3-8+亞群比例增高。
　　2、TB患者<60歲初治組復(fù)治組的Vδ2+亞群在總γδT細(xì)胞中比例明顯低于正常人<60歲組的比例。TB患者<60歲初治組復(fù)治組的Vδ1+亞群在總γδ T細(xì)胞中比例明顯高于正常人<60歲組的比例。TB患者>60歲復(fù)治組的Vδ3-8+亞群在總γδ T細(xì)胞中比例明顯高于正常人>60歲組的比例。
　　3、在正常人及TB患者，Tγδ17細(xì)胞中均以Vδ3-8亞群最多（60％以上）；正常

12、人Tγδ17細(xì)胞中Vδ2亞群最少（半數(shù)人群檢測不到），而TB患者中的Tγδ17細(xì)胞中Vδ2亞群明顯升高；TB患者的Tγδ17細(xì)胞中Vδ1亞群明顯低于正常人。
　　4、正常人PBMC，用Mtb-HAg和磷酸抗原（HDMAPP）激活γδT細(xì)胞并同時加入含誘導(dǎo)性細(xì)胞因子（IL-1β、IL-23和TGF-β）培養(yǎng)（12天）后，均可誘導(dǎo)Tγδ17細(xì)胞的分化和增殖。前者誘導(dǎo)產(chǎn)生Tγδ17細(xì)胞的數(shù)量明顯多于后者。但在前者誘導(dǎo)的Tγδ17細(xì)胞中，