LIPUS加速大鼠正畸牙槽骨改建過程中BMP-2相關(guān)信號通路的機制探討.pdf

1、加速牙槽骨改建進而加快正畸牙齒移動速度是正畸醫(yī)生和正畸患者最盼望的事情。牙齒移動與應用正畸力的反應密切相關(guān),而正畸力是牙周組織改建特別是牙槽骨改建的關(guān)鍵因素。牙周膜是牙槽骨與牙骨質(zhì)之間一層薄薄的致密結(jié)締組織,有自我更新和修復能力,在維持牙周組織動態(tài)平衡方面起著十分重要的作用。人類牙周膜細胞(human periodontal ligament cells,hPDLCs)具有多向分化潛能,并且在牙槽骨改建過程中起重要作用。低強度脈沖超聲(

2、Low-intensity pulsed ultrasound,LIPUS)刺激已經(jīng)被報道為促進骨折愈合和治療骨不連等疾病,并且可以在牽張成骨術(shù)后加速骨的成熟和改建的速度。骨形成蛋白(Bone morphogenetic proteins,BMPs)是多功能的生長因子,作為成骨誘導的信號蛋白,它們不僅引起多種細胞的增殖、分化和凋亡等功能,而且可以參與組織的再生和修復,特別是在骨組織的改建過程中發(fā)揮著非常重要的作用,其中以BMP-2誘骨活

3、性最強。肝細胞生長因子(Hepatocyte growth factor,HGF)可以刺激成骨細胞的增殖以及分化,并且HGF在介導骨形成的過程中可能有激活成骨轉(zhuǎn)錄因子Runx2(Runt-related transcription factor2,Runx2)的作用。Runx2是一種成骨分化特異性轉(zhuǎn)錄因子,在成骨細胞的形成以及分化,破骨細胞的形成和活化等過程中都發(fā)揮著重要的作用,此外,Runx2的信號通路可能參與了LIPUS刺激增加了B

4、MP-2的表達。受活化的NFκB的配體(Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand,RANKL)是調(diào)控破骨細胞形成的關(guān)鍵因子,并且可以參與正畸過程中牙槽骨的改建。
　　研究目的:
　　LIPUS刺激對HGF/Runx2/BMP-2信號通路以及RANKL表達的影響,以及它們是否加速了牙槽骨改建等類似研究非常有限,本研究旨在探討在大鼠正畸牙齒移動過程中LIPUS刺激對這

5、些因子表達的影響。
　　研究方法:
　　1.在大鼠的上頜第一磨牙和中切牙間放置正畸裝置,所有大鼠在安放牙齒移動裝置后的第2天開始對大鼠實驗側(cè)上頜第一磨牙處進行LIPUS刺激。觀察刺激后第0,1,3,5,7,14天大鼠上頜第一磨牙移動距離以及上頜第一磨牙牙齦表面溫度在各個時間點的變化,同時觀察各組大鼠上頜第一磨牙張力側(cè)牙周組織BMP-2免疫組織化學染色結(jié)果。
　　2.觀察第0,3,7天大鼠上頜第一磨牙壓力側(cè)牙周組織HE染

6、色,用qRT-PCR法和Western blot(WB)檢測LIPUS刺激第0,3,7天大鼠上頜第一磨牙壓力側(cè)牙周組織RANKL mRNA和蛋白的表達。
　　3.用qRT-PCR法和WB法檢測LIPUS刺激第0,3,7天大鼠上頜第一磨牙張力側(cè)牙周組織HGF,Runx2,BMP-2的mRNA和蛋白的表達。
　　4.原代培養(yǎng)和鑒定人類牙周膜細胞(Human periodontal ligament cells,hPDLCs),并

7、且對其進行LIPUS刺激。qRT-PCR法和WB法檢測LIPUS刺激第0,1,3,5,7,14天后hPDLCs中BMP-2mRNA和蛋白的表達。
　　5.將hPDLCs在含有0 ng/ml,5ng/ml,10ng/ml濃度HGF的培養(yǎng)基中37℃恒溫培養(yǎng)24 h,qRT-PCR法檢測hPDLCs中BMP-2mRNA的表達,WB法檢測培養(yǎng)48h后hPDLCs中BMP-2蛋白的表達。將轉(zhuǎn)染了Runx2 siRNA以及control si

8、RNA的hPDLCs在37℃恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后,用qRT-PCR法和WB法檢測LIPUS刺激5天后各組BMP-2mRNA和蛋白的表達。
　　6.觀察LIPUS刺激hPDLCs第0,1,3,5,7,14天后,對實驗組和對照組hPDLCs增殖的影響。將培養(yǎng)hPDLCs的6孔板分別在37℃,38℃,39℃的恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14天后,qRT-PCR法和WB法檢測hPDLCs中BMP-2mRNA和蛋白的表達。
　　研究結(jié)

9、果:
　　1.實驗組大鼠正畸過程中牙齒移動的量在第5,7,14天明顯超過對照組(P<0.05)。定量分析實驗組與對照組BMP-2免疫組織化學結(jié)果,實驗組第3天,5天,7天和14天BMP-2陽性細胞數(shù)比對照組數(shù)目明顯增加(P<0.05)。在LIPUS刺激過程中,牙齦表面的溫度有一定幅度的上升。
　　2.根據(jù)HE染色結(jié)果,與對照組相比,實驗組LIPUS刺激在第3天增加了破骨細胞的數(shù)目(P<0.05),而在第7天顯著增加了破骨細胞

10、的數(shù)目(P<0.01)。大鼠上頜第一磨牙壓力側(cè)牙周組織在LIPUS刺激下的RANKL的mRNA以及蛋白表達在第3天比對照組有顯著增加(P<0.01),而第7天比對照組有非常顯著增加(P<0.001)。
　　3.大鼠上頜第一磨牙張力側(cè)牙周組織在LIPUS刺激下的HGF,Runx2,BMP-2的mRNA以及蛋白的表達在第3天比對照組增加(P<0.05),而第7天比對照組有顯著增加(P<0.01)。
　　4.hPDLCs中BMP-

11、2的mRNA以及蛋白的表達隨著時間的增長而明顯升高,與對照組相比,實驗組細胞的BMP-2 mRNA在第3-14天的表達顯著增加,在第7天達到高峰,并且一直到第14天持續(xù)升高(P<0.05)。
　　5.hPDLCs在含有5ng/mlHGF的培養(yǎng)液培養(yǎng)24個小時之后BMP-2mRNA的表達量以及蛋白表達量有增加(P<0.05),而在含有10ng/ml HGF的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24小時后則有顯著增加(P<0.01)。用Runx2 siRNA

12、預處理的hPDLCs和對照組相比,在LIPUS刺激下減少了BMP-2mRNA和蛋白的表達,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　6.實驗組和對照組hPDLCs在第0,1,3,5,7,14天并沒有明顯的差別,即LIPUS刺激對hPDLCs的增殖沒有影響(P>0.05)。同時隨著培養(yǎng)溫度的升高,hPDLCs中BMP-2 mRNA以及蛋白的表達并沒有明顯的改變(P>0.05)。
　　結(jié)論:
　　綜上所述,在大鼠正畸牙齒移動