ApoE修飾的Lipofectamine 2000介導(dǎo)HSV-tk基因?qū)Ω伟饔玫难芯?pdf

1、目的：
　　1.將ApoE（載脂蛋白E）與陽(yáng)離子脂質(zhì)體Lipofectamine2000偶聯(lián)，構(gòu)建能特異轉(zhuǎn)染肝（癌）細(xì)胞的基因運(yùn)載體。
　　2.檢測(cè)在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，ApoE-Lipofectamine2000的轉(zhuǎn)染特異性及轉(zhuǎn)染效率，并檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞的毒性作用。
　　3.通過(guò)ApoE-Lipofectamine2000介導(dǎo)的pcDNA3.1-pSurvivin-TK聯(lián)合更昔洛韋（GCV）系統(tǒng)的體內(nèi)抑制試驗(yàn)，觀察該系統(tǒng)對(duì)裸

2、鼠肝癌模型的靶向殺傷作用。
　　方法：
　　1.將ApoE與Lipofectamine2000偶聯(lián)，制備ApoE修飾的Lipofectamine2000。
　　2.在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，質(zhì)粒包裹實(shí)驗(yàn)分析脂質(zhì)體與質(zhì)粒的結(jié)合比；脂質(zhì)體攜帶 pGenesil-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞 HL-7702、肝癌細(xì)胞 HepG2、人胚腎細(xì)胞HEK293T、大腸癌細(xì)胞SW480，并通過(guò)熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率；MTT法分析脂質(zhì)體對(duì)細(xì)胞的

3、毒性作用。
　　3.在體內(nèi)試驗(yàn)中，將HepG2細(xì)胞接種于裸鼠右腋皮下，建立肝癌裸鼠移植瘤模型；待腫瘤長(zhǎng)至約為200 mm3時(shí)，將荷瘤裸鼠隨機(jī)分為三組；A組：腫瘤空白對(duì)照組；B組：Lipofectamine2000+pcDNA3.1-pSurvivin-TK+GCV治療組；C組：ApoE-Lipofectamine2000+pcDNA3.1-pSurvivin-TK+GCV治療組。觀察各組治療后瘤體積及瘤重的變化，計(jì)算抑瘤率；RT-

4、PCR法與Western blotting法觀察脂質(zhì)體介導(dǎo)的HSV-tk質(zhì)粒在瘤組織中的表達(dá)情況；HE染色與TUNEL法觀察治療后移植瘤的凋亡壞死情況。
　　結(jié)果：
　　1.制備ApoE修飾的Lipofectamine2000運(yùn)載體，質(zhì)粒包裹實(shí)驗(yàn)顯示質(zhì)粒與Lipofectamine2000和ApoE修飾的Lipofectamine2000的質(zhì)量體積比分別為1：2，1：2.5時(shí)，可完全包裹質(zhì)粒。
　　2.流式結(jié)果表明，A

5、poE-Lipofectamine2000對(duì)HL-7702和HepG2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率明顯高于Lipofectamine2000，轉(zhuǎn)染效率有顯著性差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P=0.03，P=0.001)。在HEK293T、SW480細(xì)胞中，兩種脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率無(wú)明顯差異，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，P=0.93，P=0.55）。
　　3. MTT實(shí)驗(yàn)表明ApoE修飾后的Lipofectamine2000沒(méi)有增加Lipofec

6、tamine2000對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性作用（P>0.05）。
　　4.成功建立裸鼠肝癌移植瘤模型；治療后，與對(duì)照組相比，瘤體積和瘤重均減小，B、C組抑瘤率分別為（29.46±2.51）％，（46.18±1.79）%，二者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05, P=0.007）。
　　5. Western blotting與RT-PCR結(jié)果顯示，在A組未見明顯條帶，B、C兩組均檢測(cè)到HSV-tk質(zhì)粒成功表達(dá)。
　　6.

7、 HE染色與TUNEL法顯示，兩種脂質(zhì)體介導(dǎo)的HSV-tk質(zhì)粒聯(lián)合GCV治療對(duì)肝癌移植瘤均具有一定的殺傷作用，但ApoE修飾后的Lipofectamine2000介導(dǎo)的抑制作用更明顯。
　　結(jié)論：
　　1.成功構(gòu)建了一種肝癌靶向基因遞送載體，ApoE-Lipofectamine2000。
　　2. ApoE修飾的Lipofectamine2000對(duì)肝（癌）細(xì)胞具有較高的親和力，能夠靶向轉(zhuǎn)染肝（癌）細(xì)胞。
　　3.