Class C1 Decoy ODN 聯(lián)合Smad3 Decoy ODN抑制活化的大鼠肝星狀細(xì)胞中TGF-β信號的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：肝星狀細(xì)胞（HSC）的活化是肝纖維化過程中的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。TGF-β信號通路在肝纖維化過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。HES1的蛋白表達(dá)與活化的肝星狀細(xì)胞呈正相關(guān)關(guān)系，它所屬的一類轉(zhuǎn)錄因子能與DNA結(jié)合序列class C（CACGNG）結(jié)合。通過轉(zhuǎn)錄因子圈套策略（Decoy ODN）篩選出能抑制TGF-β信號通路的class C Decoy ODNs，來抑制HSC的活化。另外，將有效的class C Decoy ODNs與Smad3 Dec

2、oy ODN聯(lián)合作用活化的肝星狀細(xì)胞，觀察對TGF-β信號通路的抑制作用能否更好。
　　方法：
　　(1)通過生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測分析TGF-β信號通路中TGF-β及其下游靶基因（如COLΙα1、TIMP1、α-SMA等）的啟動子區(qū)與class C序列匹配程度；
　　(2)通過熒光素酶報告基因分析法檢測class C Decoy ODNs對TGF-β信號通路中TGF-β及其下游靶基因啟動子活性的影響；
　　(3)通

3、過Western blot方法進(jìn)一步驗(yàn)證class C Decoy ODNs對TGF-β信號通路中TGF-β及其下游靶基因在蛋白水平的影響；
　　(4)通過熒光素酶報告基因分析法檢測能影響TGF-β及其下游靶基因啟動子活性的Decoy ODNs組合。
　　結(jié)果：
　　(1)通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)TGF-β及其靶基因COLΙα1、TIMP1、α-SMA以及HES1的啟動子上有class C序列的存在，而COLΙα2的基因

4、啟動子區(qū)內(nèi)沒有class C序列存在；
　　(2)通過熒光素酶報告基因分析法檢測出能下調(diào)TGF-β信號通路中TGF-β及其下游靶基因啟動子或增強(qiáng)子水平的class C Decoy ODNs，其中包括class C1 Decoy ODN、class C2 Decoy ODN、class C3 Decoy ODN以及class C4 Decoy ODN；
　　(3) Western blot進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)4種class C De

5、coy ODNs中，對TGF-β及其靶基因影響范圍較廣的是class C1 Decoy ODN，下調(diào)效果相對較好的是class C2 Decoy ODN，而class C3 Decoy ODN與class C4 Decoy ODN對其影響效果差；
　　(4)通過熒光素酶報告基因分析法篩選出一定程度上能影響TGF-β及其下游靶基因啟動子活性的Decoy ODN組合，包括class C1 Decoy ODN與Smad3 Decoy O

6、DN的組合，以及class C2 Decoy ODN與Smad3 Decoy ODN的組合，而且第一種組合比第二種組合對TGF-β及其下游靶基因啟動子活性下調(diào)作用好。
　　結(jié)論：Class C1/2 Decoy ODN能通過抑制TGF-β信號來抑制大鼠肝星狀細(xì)胞的活化。Class C1 Decoy ODN聯(lián)合Smad3 Decoy ODN，能夠下調(diào)活化的大鼠肝星狀細(xì)胞中，TGF-β應(yīng)答元件TRE活性，以及TGF-β靶基因TIMP1