大花蕙蘭體外再生優(yōu)化、感病葉差異蛋白初探及模式植物抗病毒機(jī)制研究.pdf

1、蘭科植物（Orchidaceae）是僅次于菊科的一個(gè)大科,是單子葉植物中的第一大科,是真正稱得上世界名花的植物,具有重大經(jīng)濟(jì)效益和應(yīng)用前景的觀賞和藥用價(jià)值。但是,蘭科植物受病毒病嚴(yán)重侵害而無(wú)法根治的問題,是阻礙蘭科植物正常生長(zhǎng)、蘭科珍惜種質(zhì)資源保存及蘭花產(chǎn)業(yè)發(fā)展。對(duì)于蘭科植物多年生植物來(lái)說(shuō),轉(zhuǎn)基因過程中得外植體再生頻率低、離體培養(yǎng)周期長(zhǎng)、易受污染等問題仍然是多年生植物抗病毒株獲得的瓶頸。本氏煙具有易于栽培、生長(zhǎng)迅速、繁殖性強(qiáng)、離體再生頻

2、率高等特點(diǎn),通常成為實(shí)驗(yàn)室理想的模式植物和研究材料。本研究利用植物組織培養(yǎng)技術(shù),優(yōu)化了大花蕙蘭體外再生繁殖體系。也對(duì)感染病毒的成齡大花蕙蘭葉片進(jìn)行差異表達(dá)蛋白初步探討?；谥参颮NA沉默機(jī)制,對(duì)大花蕙蘭和模式植物本氏煙草抗病毒基因工程初步研究,其研究成果對(duì)蘭花產(chǎn)業(yè)具有重要應(yīng)用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益。本實(shí)驗(yàn)主要研究結(jié)果如下:
　　 1、利用植物組織培養(yǎng)技術(shù),建立了大花蕙蘭和本氏煙草的再生繁殖體系。以大花蕙蘭莖尖為外植體,研究6-BA與NA

3、A濃度梯度配比對(duì)大花蕙蘭原球莖的誘導(dǎo)、增殖及分化的影響。結(jié)果表明,6-BA1.0mg/L+NAA0.5mg/L濃度配比下,大花蕙蘭莖尖存活率達(dá)到93.3％;6-BA0.8mg/L+NAA0.4mg/L濃度配比下,原球莖誘導(dǎo)率達(dá)到85.8％;6-BA1.0mg/L+NAA0.3mg/L濃度配比下,原球莖增殖系數(shù)達(dá)到4.59;6-BA0.8mg/L+NAA0.5mg/L濃度配比下,原球莖出芽率達(dá)到87.5％。本研究首次報(bào)道采用6-BA0.8

4、mg/L+NAA0.5mg/L濃度配比組合適合大花蕙蘭莖尖培養(yǎng),可同時(shí)獲得較高的原球莖誘導(dǎo)率(80.8％)和出芽率(87.5％),比目前已報(bào)道的最佳原球莖誘導(dǎo)率(72.7％)和出芽率(76.7％)提高8％以上。
　　 2、本實(shí)驗(yàn)將包含CymMV和ORSV的沉默載體與選擇性標(biāo)記載體pCAMBIA1301直接通過基因槍法轉(zhuǎn)入大花蕙蘭原球莖中,在讓原球莖增殖、長(zhǎng)芽、生根,再基于植物RNA沉默機(jī)制,再用外緣的CymMV和ORSV病汁液進(jìn)

5、行侵染大花蕙蘭,觀察染病結(jié)果。經(jīng)由實(shí)驗(yàn)檢測(cè),對(duì)沉默載體和標(biāo)記載體的提取和鑒定,已將CymMV和ORSV的沉默載體已經(jīng)轉(zhuǎn)入大花蕙蘭中,由于實(shí)驗(yàn)室污染問題,暫時(shí)沒有得到轉(zhuǎn)基因苗,下一步實(shí)驗(yàn)繼續(xù)進(jìn)行中。
　　 3、本研究分別對(duì)健康,感染ORSV和感染CymMV+ORSV病毒的成齡大花蕙蘭葉片總蛋白提取,在進(jìn)行雙向電泳,然后得到蛋白質(zhì)點(diǎn)的圖譜,通過分析軟件分析可得出,健康、感染ORSV和CymMV+ORSV病毒大花蕙蘭雙向電泳圖中蛋白點(diǎn)

6、數(shù)分別是199個(gè)、256個(gè)、278個(gè),健康與感染ORSV病毒的雙向電泳圖比較,有8個(gè)點(diǎn)是上調(diào)或下調(diào),健康與感染CymMV+ORSV病毒的雙向電泳圖比較,有4個(gè)點(diǎn)是上調(diào)或下調(diào),而感染ORSV病毒的雙向電泳圖中有無(wú)點(diǎn)有9個(gè),感染CymMV+ORSV病毒的雙向電泳圖中有無(wú)點(diǎn)有12個(gè),分別對(duì)以上點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜差異表達(dá)分析,其研究結(jié)果將從蛋白質(zhì)水平上為揭示病毒介導(dǎo)的寄主互作機(jī)制以及可能的病毒互作蛋白,為研究大花蕙蘭與病毒互作生理生化的影響,探討了大花

7、蕙蘭對(duì)病毒侵染響應(yīng)的分子機(jī)理,為培育新型抗病品種提供了理論依據(jù)。
　　 4、本研究基于植物RNA沉默機(jī)制,通過對(duì)注射接種沒有RNA酶的水的對(duì)照植株、PVX/GFP的植株、PVX/NbRBR1-GFP的植株、PVX/NbPCNAGFP的植株,觀察本氏煙草植株的病毒誘導(dǎo)基因沉默表型,研究本氏煙草NbRBR1和NbPCNA基因的沉默對(duì)ACMV的生命周期特別是DNA復(fù)制的影響。研究結(jié)果表明內(nèi)源性NbRBR1和NbPCNA基因表達(dá)的病毒誘