沼澤紅假單胞菌CQU01AHL合成酶基因的鑒定、表達(dá)及對(duì)PHB積累的影響.pdf

1、群體感應(yīng)(quorum-sensing，簡(jiǎn)稱QS)系統(tǒng)是指細(xì)菌通過(guò)一種自體誘導(dǎo)物(autoinducer，AI)的信號(hào)分子的產(chǎn)生、分泌和響應(yīng)，感知周圍細(xì)菌密度的變化，從而調(diào)控基因的表達(dá)。G-細(xì)菌的群體感應(yīng)信號(hào)分子多為?；呓z氨酸內(nèi)酯衍生物AHL；G+細(xì)菌的群體感應(yīng)信號(hào)分子通常是寡肽類；另外還有一類信號(hào)分子被認(rèn)為是細(xì)菌種間“通用”的信號(hào)分子，即呋喃酰硼酸二脂AI-2。
　　 沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudanonas pal

2、ustris)是光合細(xì)菌的一種，屬于革蘭氏陰性細(xì)菌。在光合細(xì)菌之一的類球紅細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)存在群體感應(yīng)系統(tǒng)，而且群體感應(yīng)系統(tǒng)還調(diào)控菌體內(nèi)聚-β-羥丁酸(poly-β-hydroxybutyric acid，簡(jiǎn)稱PHB)的積累和光合產(chǎn)氫。沼澤紅假單胞菌也積累PHB和光合產(chǎn)氫，有文獻(xiàn)報(bào)道在沼澤紅假單胞菌內(nèi)發(fā)現(xiàn)AHL類信號(hào)分子的存在，但是群體感應(yīng)系統(tǒng)是否對(duì)PHB積累有調(diào)控作用還未可知。
　　 比色法和報(bào)告菌株Agrobacterium tu

3、mefaciens JZA1[KYC55(pJZ372)(pJZ384)(pJZ410)]對(duì)沼澤紅假單胞菌CQU01產(chǎn)生自體誘導(dǎo)物AHL的能力做了檢測(cè)，比色法結(jié)果顯示沼澤紅假單胞菌CQU01的AHL提取液通過(guò)顏色反應(yīng)，變成咖啡色，說(shuō)明沼澤紅假單胞菌CQU01產(chǎn)生自體誘導(dǎo)物AHL；但是其上清液不能使報(bào)告菌株JZA1顯藍(lán)色，說(shuō)明產(chǎn)生的信號(hào)分子超出了JZA1的檢測(cè)范圍，其酰胺鏈上的碳原子數(shù)可能大于14或者含有雙鍵。
　　 根據(jù)NCBI

4、公布的5株沼澤紅假單胞菌的基因序列，通過(guò)同源性比對(duì)，設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物。以沼澤紅假單胞菌CQU01的基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增出650bp左右的DNA片段，測(cè)序比對(duì)發(fā)現(xiàn)此片段為自誘導(dǎo)物AHL合成酶基因RpaI。將擴(kuò)增的DNA片段連接到pET-28a(+)，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中；藍(lán)白斑篩選，誘導(dǎo)表達(dá)，檢測(cè)到DH5α菌液中有AHL產(chǎn)生。說(shuō)明以沼澤紅假單胞菌CQU01為模板擴(kuò)增到得DNA片段為AHL合成酶基因，并且將該基因在大腸桿菌

5、DH5α中克隆表達(dá)，得到AHL信號(hào)分子。
　　 利用乙酸乙酯萃取AHL，在接種沼澤紅假單胞菌CQU01和沼澤紅假單胞菌phbC缺陷菌株的培養(yǎng)基中添加不同濃度的AHL萃取液，通過(guò)測(cè)定沼澤紅假單胞菌CQU01和沼澤紅假單胞菌phbC缺陷菌株的PHB含量，發(fā)現(xiàn)厭氧生長(zhǎng)時(shí)沼澤紅假單胞菌CQU01的PHB積累減少；而沼澤紅假單胞菌phbC缺陷菌株的PHB積累幾乎沒有變化。說(shuō)明AHL可以抑制PHB積累；并且抑制作用很可能發(fā)生于PHB合酶途徑