內(nèi)切幾丁質(zhì)酶全基因合成及其在畢赤酵母中表達(dá)和發(fā)酵條件優(yōu)化的研究.pdf

1、幾丁質(zhì)是由N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine,GlcNAc)通過β-1,4-糖苷鍵連接而成的高分子聚合物,是僅次于纖維素的第二大可再生資源。幾丁質(zhì)的中間降解產(chǎn)物幾丁寡糖是一種具有獨(dú)特生理活性的功能性低聚糖,分子量小、溶解性好、易于吸收的特性使其在生物醫(yī)藥、食品、化妝品、紡織、農(nóng)業(yè)等各領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。但傳統(tǒng)工藝應(yīng)用酸堿法來(lái)提取制備幾丁質(zhì)相關(guān)產(chǎn)品,容易造成較為嚴(yán)重的環(huán)境污染。因此,研究開發(fā)合適的、沒有污染的生

2、物酶法降解幾丁質(zhì)的生產(chǎn)工藝,以代替?zhèn)鹘y(tǒng)工藝制備幾丁寡糖及N-乙酰葡萄糖胺,以及合成新幾丁質(zhì)酶基因并構(gòu)建高效表達(dá)工程菌等,已是一個(gè)迫在眉睫的并具有重大經(jīng)濟(jì)價(jià)值與理論價(jià)值的研究課題。
　　 本研究采用Successive PCR技術(shù),合成了基于巴斯德畢赤酵母的偏愛性的內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因序列SECH,將該基因序列克隆至載體pPIC9K中,得到真核表達(dá)載體pPIC9K-SECH,通過線性化及電擊法轉(zhuǎn)化至巴斯德畢赤酵母中,再根據(jù)生長(zhǎng)情況快速

3、篩選出G418抗性較高的陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化子ZJGSU04,用DNS法測(cè)定了重組菌產(chǎn)生的內(nèi)切幾丁質(zhì)酶活力,并通過SDS-PAGE對(duì)該基因表達(dá)的蛋白產(chǎn)物進(jìn)行了分析。在此基礎(chǔ)上利用部分因子實(shí)驗(yàn)(FFD)及響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)初步優(yōu)化了重組菌的產(chǎn)酶條件。本研究主要取得了以下結(jié)果:
　　 1.根據(jù)巴斯德畢赤酵母密碼子的偏愛性和內(nèi)切幾丁質(zhì)酶的基因序列,設(shè)計(jì)14對(duì)引物,采用Successive PCR技術(shù)合成一段大小為1185bp的DNA片段,通過序列對(duì)比

4、后發(fā)現(xiàn)合成的內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因與本實(shí)驗(yàn)室前期克隆獲得的綠色木霉內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因序列不同,但是氨基酸序列沒有變化,說(shuō)明成功合成了基于巴斯德畢赤酵母密碼子偏愛性的內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因序列。
　　 2.用EcoRI和NotI分別雙酶切內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因SECH和pPIC9K質(zhì)粒DNA,用T4DNA連接酶連接回收的目的條帶,得到真核表達(dá)載體pSECH,用CaCl2法將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α。利用Kana抗性篩選單菌落。所選轉(zhuǎn)化克隆經(jīng)PCR、酶

5、切鑒定和DNA測(cè)序測(cè)定證明克隆正確,從而獲得了重組質(zhì)粒pPIC9K-SECH。
　　 3.將重組質(zhì)粒pPIC9K-SECH經(jīng)Bpu1102I線性化處理并電擊轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母GS115,通過G418加壓篩選獲得了能夠高效表達(dá)內(nèi)切幾丁質(zhì)酶的轉(zhuǎn)化子ZJGSU04。通過DNS法測(cè)定內(nèi)切幾丁質(zhì)酶活為23.09 U/mL,SDS-PAGE及酶譜分析證明內(nèi)切幾丁質(zhì)酶成功的獲得了表達(dá),分子量約為43kDa。
　　 4.使用單因素實(shí)驗(yàn)研

6、究了甲醇、油酸、Tween-80、PTM1以及pH值對(duì)重組內(nèi)切幾丁質(zhì)酶表達(dá)量的影響。單因素結(jié)果表明:甲醇的最佳誘導(dǎo)濃度為0.5％;添加0.05％的油酸、0.3％的Tween-80、0.8％的PTM1明顯有利于重組內(nèi)切幾丁質(zhì)酶的表達(dá);酸性或堿性環(huán)境不利于重組內(nèi)切幾丁質(zhì)酶的表達(dá),應(yīng)將培養(yǎng)基pH值維持在6.0左右。在此基礎(chǔ)上,通過Fractional Factorial Design(FFD)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),確定了甲醇、油酸和Tween-80是影響

7、重組酵母表達(dá)內(nèi)切幾丁質(zhì)酶的關(guān)鍵因素,并選取甲醇、油酸和Tween-80三個(gè)因素進(jìn)行了響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。通過Design-expert7.0軟件進(jìn)行了設(shè)計(jì)和分析,得到發(fā)酵生產(chǎn)重組內(nèi)切幾丁質(zhì)酶的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為:1.00％酵母膏、2.00％蛋白胨、1.34％YNB、100 mM磷酸緩沖液(pH6.0)、0.71％甲醇、0.086％油酸、0.31％Tween-80、0.80％PTM1、4.00×10-5％生物素。在最佳培養(yǎng)條件下,經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)