Wolbachia誘導(dǎo)昆蟲宿主細胞質(zhì)不親和的分子機理研究.pdf

1、沃爾巴克氏體(Wolbachia)是一類革蘭氏陰性細菌，廣泛存在于多種節(jié)肢動物的生殖細胞或體細胞中，能夠通過宿主卵細胞質(zhì)傳遞給子代。最新的研究表明，除了在絲狀線蟲、陸生等足動物、蜘蛛目和蜱螨目中存在外，其在昆蟲中的分布更為廣泛，超過65％以上的昆蟲種類中都發(fā)現(xiàn)有Wolbachia感染，包括直翅目、膜翅目、半翅目、鞘翅目、雙翅目和同翅目等。目前，Wolbachia的研究已成為國內(nèi)外熱點領(lǐng)域之一，主要原因是它能對宿主的生殖產(chǎn)生多種調(diào)節(jié)作用，

2、包括雌性化、孤雌生殖、殺雄、精卵細胞質(zhì)不親和(CI)等，正是由于這些調(diào)節(jié)作用，使Wolbachia得以在宿主種群內(nèi)成功傳播。其中，CI是最為普遍的表型，即當Wolbachia感染的雄性宿主受精于未感染或感染了不同Wolbachia菌株的雌性宿主時，產(chǎn)生的后代由于發(fā)育缺陷在胚胎時期死亡。而感染相同Wolbachia菌株的雌性和雄性宿主在交配后則能產(chǎn)生正常發(fā)育并攜帶Wolbachia的后代。有關(guān)CI的分子機制直到現(xiàn)在仍未得到明確的解釋。研究

3、發(fā)現(xiàn)，在CI胚胎進行核分裂時，雄性原核出現(xiàn)染色質(zhì)問橋，因此無法正常存活。
　　 本研究首次對我國六個不同地區(qū)黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)體內(nèi)Wolbachia的感染狀況進行檢測，發(fā)現(xiàn)湖北武漢、天津、云南六庫地區(qū)的黑腹果蠅均被Wolbachia感染，而其它三個地區(qū)(海南尖峰嶺、河南雞公山、西藏下察隅)無感染現(xiàn)象。通過克隆得到它們的wsp基因序列，提交GenBank，注冊號分別為：FJ403330，F(xiàn)J

4、403331，F(xiàn)J403332。并對所得序列進行系統(tǒng)進化分析表明，感染這三個地區(qū)果蠅的Wolbachia品系之間親緣關(guān)系十分相近，均屬于A大組的Mel亞群。
　　 Hira是一種組蛋白調(diào)節(jié)基因，其突變也能引起果蠅的雄性原核發(fā)育障礙，為了研究CI與Hira基因的關(guān)系，我們首先通過qRT-PCR的方法檢測了不同感染狀態(tài)下，宿主果蠅Hira基因的表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在Wolbachia感染能引起強CI表型(后代胚胎孵化率很低)的雄性果

5、蠅中，Hira表達水平顯著低于弱CI表型或未感染的雄果蠅。由于CI的強度隨雄性宿主日齡的增加逐漸下降，通過分析1 d和5 d雄蠅中Hira的表達水平發(fā)現(xiàn)，5 d雄蠅中Hira的表達水平顯著高于1 d的雄果蠅。此外，考慮到宿主果蠅幼蟲發(fā)育時間與CI強度密切相關(guān)，幼蟲發(fā)育期長的雄性果蠅引起的CI強度越低(后代胚胎孵化率升高)，通過比較感染wMelPop但幼蟲發(fā)育時間不同的雄性果蠅中Hira基因的表達，發(fā)現(xiàn)隨著幼蟲發(fā)育期的延長，其體內(nèi)Hira

6、基因表達水平逐漸升高。幼蟲發(fā)育速度最快的果蠅“兄長”引起的CI強度最高，但其體內(nèi)Hira基因表達水平卻最低。這些結(jié)果表明，Wolbachia感染引起雄性果蠅體內(nèi)Hira基因表達下調(diào)可能是導(dǎo)致CI的原因之一。
　　 為了探究這種現(xiàn)象是否只發(fā)生在果蠅這種單一宿主上，通過檢測埃及伊蚊(傳播登革熱病毒的主要媒介昆蟲)中Hira的表達，發(fā)現(xiàn)了與果蠅中類似的結(jié)果，即CI強度越高，引起CI的雄蚊體內(nèi)Hira的表達量越低。為了進一步證明Wolb

7、achia感染引起雄性宿主體內(nèi)Hira基因表達下調(diào)是導(dǎo)致CI的原因，利用RNA干擾(RNAi)技術(shù)，將未感染雄蚊中的Hira基因敲降，模擬感染W(wǎng)olbachia雄蚊的狀況，然后將之與未感染雌蚊進行交配，結(jié)果產(chǎn)生了類似CI的表型，即導(dǎo)致子代胚胎孵化率下降，并且感染W(wǎng)olbachia的雌蚊能夠部分挽救這種由于雄蚊Hira基因敲降引起的缺陷。體外細胞學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，一種與Hira基因具有明顯互補序列的微小RNA(aae-miR-12)在感染和未感

8、染W(wǎng)olbachia的埃及伊蚊細胞中表達水平存在差異。與未感染的Aag2細胞相比，aae-miR-12在感染wMelPop-CLA的蚊子細胞中的表達水平上調(diào)，這種結(jié)果是與Hira基因表達情況截然相反，表明aae-miR-12可能與Wolbachia感染有關(guān)，并可能對Hira基因的表達起調(diào)控作用。為了進一步驗證這一假說，我們將人工合成的aae-miR-12類似物和抑制物分別轉(zhuǎn)染細胞，并檢測細胞中Hira基因的表達情況，發(fā)現(xiàn)aae-miR-

9、12對Hira基因表達具有明顯抑制作用。當把aae-miR-12類似物轉(zhuǎn)染到未感染W(wǎng)olbachia的蚊子細胞后，細胞中Hira基因表達明顯下調(diào)；然而，當把aae-miR-12抑制物轉(zhuǎn)染入感染wMelPop-CLA的細胞時，Hira基因表達水平與對照相比顯著上升。而利用體外構(gòu)建pIZ/GFP-Hira載體，以GFP為報告基因的方法，發(fā)現(xiàn)aae-miR-12可以通過與Hira基因序列的互補配對來抑制其表達。因此，從以上結(jié)果推測，在埃及伊蚊

10、中，Hira基因的表達可能受到一種微小RNA-aae-miR-12的負調(diào)控作用。Wolbachia感染可能通過上調(diào)aae-miR-12表達，抑制Hira基因表達，最終導(dǎo)致宿主CI的表型，這個結(jié)果將為研究Wolbachia與宿主相互關(guān)系提供一條新的思路。
　　 為了全面探究Wolbachia感染引起CI的分子機制，通過microarray技術(shù)比較了感染和未感染W(wǎng)olbachia的雄性果蠅三齡幼蟲的精巢中差異表達的基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有

11、296個基因表達量發(fā)生至少1.5倍以上的改變(q<0.05)，這些基因的功能涉及到新陳代謝、免疫、生殖等。其中，167個基因發(fā)生上調(diào)，129個基因發(fā)生下調(diào)。采用定量RT-PCR的方法進一步驗證了部分基因，證明其表達改變模式與microarray的結(jié)果一致。有趣的是，Wolbachia感染導(dǎo)致與免疫相關(guān)的基因大部分出現(xiàn)上調(diào)，而與生殖相關(guān)的基因則多數(shù)下調(diào)。根據(jù)這些結(jié)果我們推測，Wolbachia可能一方面激活了宿主的免疫途徑，另一方面卻對其