moesin-FERM蛋白、鈣調(diào)蛋白(CaM)與L-selectin肽段相互作用的研究及其共結(jié)晶.pdf

1、胞外區(qū)脫落是許多蛋白質(zhì)近膜旁的作用位點(diǎn)在蛋白酶的作用下發(fā)生降解的過程，該過程是細(xì)胞內(nèi)許多信號通路的關(guān)鍵步驟，脫落過程的改變可以引起心血管疾病、癌癥和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生。L-selectin作為選擇素家族中的一員，是一種普遍存在的胞外區(qū)脫落底物，蛋白質(zhì)胞外區(qū)的脫落主要依靠胞內(nèi)區(qū)的調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞內(nèi)L-selectin能同時與moesin-FERM蛋白和鈣調(diào)蛋白(CaM)結(jié)合調(diào)節(jié)其功能和胞外區(qū)的脫落，但跨膜調(diào)節(jié)作用的分子機(jī)制還尚未解析

2、。
　　多肽AFII24和RRL17是本課題根據(jù)L-selectin胞內(nèi)區(qū)和跨膜區(qū)的序列設(shè)計的兩條多肽分子，旨在模擬L-selectin的功能，并通過CD實(shí)驗(yàn)對二者的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。同時，還成功地構(gòu)建了moesin-FERM蛋白和鈣調(diào)蛋白(CaM)的重組質(zhì)粒，通過對表達(dá)和純化條件的不斷優(yōu)化，得到了高濃度純度的moesin-FERM蛋白和鈣調(diào)蛋白(CaM)。通過IT℃實(shí)驗(yàn)得到多肽AFII24與moesin-FREM蛋白的結(jié)合力常

3、數(shù)KD=558.65nM，多肽AFII24與鈣調(diào)蛋白(CaM)的結(jié)合機(jī)制是熵變和焓變共同作用的結(jié)果，多肽RRL17與moesin-FERM蛋白和鈣調(diào)蛋白(CaM)均無結(jié)合作用。進(jìn)一步，通過熒光實(shí)驗(yàn)和GST-pull down證明了三者之間的相互作用。
　　采用共結(jié)晶的方法對moesin-FERM和多肽AFII24復(fù)合物的晶體進(jìn)行了篩選，得到了一個結(jié)晶條件，但無法得到衍射數(shù)據(jù)。隨后，通過引入“Linker”的方法，成功構(gòu)建了moes