47kDa尾連蛋白(TIP47)對(duì)小鼠骨骼肌成肌細(xì)胞脂質(zhì)代謝的影響.pdf

1、生物體正常的生命活動(dòng)依賴于正常的能量供應(yīng)。骨骼肌是人體重要的運(yùn)動(dòng)器官，消耗了有機(jī)體大量的能量，因此骨骼肌又是重要的能量代謝器官。脂質(zhì)是骨骼肌中儲(chǔ)存能量的物質(zhì)，隨時(shí)水解出脂肪酸進(jìn)行β氧化提供能量。骨骼肌中脂質(zhì)代謝異常會(huì)引起胰島素抵抗，進(jìn)而發(fā)展成為糖尿病。因此，研究骨骼肌中的脂質(zhì)代謝具有重要的意義。
　　骨骼肌中的脂質(zhì)儲(chǔ)存于骨骼肌細(xì)胞的脂滴中。脂滴表面由一單層磷脂包圍，中心充滿了以甘油三酯和膽固醇酯為主的中性脂，單層磷脂膜外分布著許多

2、蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)賦予了脂滴的多功能性。脂滴不僅與脂質(zhì)代謝密切相關(guān)，還參與了細(xì)胞器之間的信息交流，發(fā)育，蛋白降解，細(xì)胞凋亡，免疫以及病毒的復(fù)制。脂滴蛋白質(zhì)PAT家族中，除了perilipin，其它PAT蛋白質(zhì)在骨骼肌脂滴上均有表達(dá):ADRP豐度最高，其次是TIP47，S3-12和OXPAT表達(dá)量較低。
　　TIP47又稱M6PRBP1，是在對(duì)陽離子依賴的M6PR進(jìn)行酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)時(shí)鑒定出來的，因其分子量大小是47 kDa，與M6P

3、R的尾端結(jié)合，因此被命名為47 kDa尾連蛋白(tail-interacting protein of47 kDa)。TIP47與M6PR結(jié)合，將M6PR從后期胞內(nèi)體轉(zhuǎn)運(yùn)回到反面高爾基體管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上。后來發(fā)現(xiàn)，小分子GTPase Rab9可以和TIP47直接相互作用，促進(jìn)TIP47與M6PR的結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)。TIP47是一個(gè)廣泛表達(dá)的蛋白質(zhì)，在胎盤、卵巢、腎上腺、腦、皮膚、脂肪、肌肉和心臟等組織或器官中均有表達(dá)，并且，TIP47在子宮頸癌組

4、織中高表達(dá)。目前，TIP47被當(dāng)作發(fā)生子宮頸癌的血液標(biāo)志和當(dāng)作子宮頸發(fā)育不良與侵潤(rùn)性癌癥的生物標(biāo)志。TIP47也在眼睛中表達(dá)，參與眼睛明亮與黑暗的適應(yīng)反應(yīng)。另外，TIP47參與肝臟脂肪變性，病毒感染和腫瘤發(fā)展過程。
　　TIP47與ADRP在氨基酸序列比對(duì)上達(dá)到43％的同源性。ADRP敲除后，TIP47可以代償ADRP的功能。TIP47可以從細(xì)胞質(zhì)中募集到脂滴上，與ADRP共同參與新生脂滴的成熟。ADRP的研究較為深入，且已經(jīng)建立

5、了基因敲除鼠，而TIP47對(duì)脂質(zhì)代謝的研究較少，作用機(jī)制遠(yuǎn)未闡明，既沒有建立TIP47敲除細(xì)胞系，更沒有TIP47基因敲除鼠的報(bào)道。因此本研究采用最新的CRISPR/Cas9基因敲除技術(shù)，敲除小鼠骨骼肌成肌細(xì)胞C2C12中的TIP47，進(jìn)一步解釋TIP47在小鼠骨骼肌細(xì)胞脂質(zhì)代謝的作用。
　　CRISPR/Cas9是細(xì)菌抵御外源遺傳物質(zhì)入侵的獲得性免疫系統(tǒng)，屬于Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)。經(jīng)過改良后，可以簡(jiǎn)便高效地用于真核細(xì)胞的

6、基因敲除和基因組編輯，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于動(dòng)物模型的建立、基因治療和動(dòng)植物育種等。其基本原理是Cas9核酸酶在單鏈指導(dǎo)RNA(sgRNA)的指引下，對(duì)特異的雙鏈DNA靶序列進(jìn)行切割產(chǎn)生雙鏈斷裂，隨后細(xì)胞進(jìn)行非同源末端連接修復(fù)或同源重組修復(fù)，導(dǎo)致產(chǎn)生堿基或片段的缺失或插入突變。
　　本研究運(yùn)用改良后的CRISPR/Cas9技術(shù)，成功敲除了小鼠骨骼肌成肌細(xì)胞C2C12中的TIP47，并獲得了幾個(gè)TIP47敲除（TIP47 KO）C2C12細(xì)

7、胞系。用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察LipidTOXTM Red脂滴染色，在正常情況下，與對(duì)照組相比，脂滴沒有變化，推斷TIP47并不影響正常情況下C2C12細(xì)胞內(nèi)中性脂和脂滴的生成。但是用200μM OA處理細(xì)胞12小時(shí)后，與對(duì)照組相比，TIP47KO的C2C12細(xì)胞內(nèi)脂滴變多，說明TIP47可能參與了C2C12細(xì)胞在OA刺激下脂質(zhì)的合成。3H標(biāo)記OA示蹤甘油三酯代謝的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，TIP47 KO的C2C12細(xì)胞，其甘油三