黑腹果蠅對(duì)甲醇的解毒代謝及行為反應(yīng).pdf

1、植物在生長(zhǎng)發(fā)育和腐爛過(guò)程中均產(chǎn)生大量甲醇。植食性的昆蟲(chóng)勢(shì)必會(huì)受到甲醇的潛在毒害。因此，這些昆蟲(chóng)在進(jìn)化過(guò)程中應(yīng)該建立了對(duì)甲醇的解毒代謝機(jī)制及行為逃避機(jī)制。然而迄今為止，在昆蟲(chóng)中僅報(bào)道了亞洲玉米螟對(duì)甲醇的解毒代謝。
　　 本論文中，我們初步探討了黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）對(duì)甲醇的解毒代謝途徑、以及包括醉酒行為、雄蠅同性求偶行為和產(chǎn)卵選擇行為在內(nèi)的多種行為反應(yīng)機(jī)制。研究結(jié)果可為昆蟲(chóng)進(jìn)化的研究和害蟲(chóng)治理措

2、施的開(kāi)發(fā)提供借鑒。
　　 1.細(xì)胞色素P450單加氧酶參與幼蟲(chóng)對(duì)甲醇的解毒代謝以黑腹果蠅2齡幼蟲(chóng)為試蟲(chóng)，分別測(cè)定了細(xì)胞色素P450單加氧酶(CYP)、過(guò)氧化氫酶、醇脫氫酶(ADHs)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶和酯酶的抑制劑增效醚(PBO)、3-氨基-1，2，4-三氮唑(3-AT)、4-甲基吡唑(4-MP)、順丁烯二酸二乙酯(DEM)和磷酸三苯酯(TPP)對(duì)甲醇和甲醛的增效作用。發(fā)現(xiàn)TPP、DEM、3-AT和4-MP與甲醇的聯(lián)合作用為

3、1.02、0.98、0.98和1.00，與甲醛的聯(lián)合作用為1.15、1.05、1.08和1.14。表明甲醇或甲醛與這4種酶抑制劑是相加作用。甲醇或甲醛與PBO混用時(shí)的聯(lián)合作用分別為0.28和0.18，顯著低于1，表明甲醇或甲醛與PBO之間是增效作用，CYP參與了黑腹果蠅幼蟲(chóng)對(duì)甲醇的解毒代謝。2齡幼蟲(chóng)取食含有濃度為22.6、27.9和34.5 mg/g甲醇的飼料后，多功能氧化酶系的活力分別提高了3.0、3.9和2.7倍，甲醇處理也顯著上調(diào)

4、了cyp304a1、cyp9f2、cyp28a5、cyp4d2和cyp4e2基因的表達(dá)水平。表明這些基因編碼的CYP可能參與了幼蟲(chóng)對(duì)甲醇的解毒代謝。
　　 2.黑腹果蠅成蟲(chóng)對(duì)甲醇的解毒代謝分別測(cè)定了甲醇和5種酶抑制劑對(duì)果蠅雌蟲(chóng)和雄蟲(chóng)的聯(lián)合作用CI。發(fā)現(xiàn)PBO和3-AT對(duì)甲醇增效作用十分明顯;TPP和4-MP對(duì)甲醇24 h之內(nèi)為相加作用，48 h和72 h后表現(xiàn)出顯著的增效作用;而DEM與甲醇混合使用是相加作用。甲醇處理誘導(dǎo)了成蟲(chóng)

5、多功能氧化酶系的活力，上調(diào)了數(shù)個(gè)cy基因mRNA表達(dá)。測(cè)定了幾個(gè)黑腹果蠅突變品系對(duì)甲醇的耐受能力，結(jié)果表明，ADH、α-Est7編碼基因被突變后，黑腹果蠅對(duì)甲醇耐受性下降;細(xì)胞色素P450單加氧酶基因cyp4e2、cyp9f2或cyp318a1分別被突變后，并不顯著影響黑腹果蠅成蟲(chóng)對(duì)甲醇的敏感性。醛脫氫酶/辛醇脫氫酶突變品系接觸甲醇最初24 h之內(nèi)，對(duì)甲醇的耐受能力明顯增加。隨后則與CS野生品系的耐受能力相似。以上結(jié)果表明，雌蠅和雄蠅對(duì)

6、甲醇的解毒代謝過(guò)程相似，細(xì)胞色素P450單加氧酶和過(guò)氧化氫酶在甲醇的解毒過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用;羧酸酯酶和羥脫氫酶需經(jīng)甲醇長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)誘導(dǎo)才發(fā)揮其最大的解毒能力;谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶不參與甲醇的解毒代謝。醛脫氫酶/辛醇脫氫酶降解甲醇的活性仍需進(jìn)一步研究。
　　 3.甲醇多代篩選對(duì)黑腹果蠅的影響黑腹果蠅CS品系累代飼養(yǎng)于含有濃度為25 mg/g甲醇的飼料上。經(jīng)40代長(zhǎng)期篩選，果蠅對(duì)甲醇的LC50值從27.93增加到40.71 mg/g

7、?，F(xiàn)實(shí)遺傳力(h2)值在篩選的前2代、3-10代和11-40代分別為0.4956、0.0315和0.0087。黑腹果蠅從卵到成蟲(chóng)的發(fā)育歷期隨篩選代數(shù)的增加而延長(zhǎng)，篩選0、2、10和40代后，在無(wú)甲醇飼料上的發(fā)育歷期分別為8.33 d、9.78 d、12.01 d和12.51 d;在有甲醇飼料上的發(fā)育歷期分別為12.59 d、14.08 d、17.37 d和18.10 d。其中胚胎和幼蟲(chóng)發(fā)育期的延長(zhǎng)尤為顯著，而蛹的發(fā)育歷期沒(méi)有顯著變化。長(zhǎng)

8、期的甲醇篩選導(dǎo)致果蠅幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)中數(shù)個(gè)編碼細(xì)胞色素P450單加氧酶和酯酶的基因表達(dá)量明顯升高。同時(shí)，這兩種酶的活力也顯著上升。以上結(jié)果表明，甲醇耐受性的提高具有一定的適合度代價(jià)。
　　 4.甲醇對(duì)黑腹果蠅醉酒行為的研究當(dāng)緩慢接觸氣體甲醇時(shí)，果蠅表現(xiàn)出一系列的行為變化:放入的最初幾分鐘，黑腹果蠅過(guò)度興奮，運(yùn)動(dòng)顯著增加;接著出現(xiàn)定向困難，協(xié)調(diào)能力下降，行動(dòng)遲緩，失去平衡能力，表現(xiàn)出人類相似的醉酒狀態(tài);并最終背部朝天，進(jìn)入完全靜止的醉倒

9、狀態(tài)。每天1次接受甲醇熏蒸，可誘導(dǎo)雄蠅對(duì)甲醇的醉倒抗性，但不誘導(dǎo)雌蠅的抗性。酶抑制劑TPP、DEM、3-AT、4-MP和PBO預(yù)處理后，可縮短雄蠅和雌蠅對(duì)甲醇的平均醉倒時(shí)間，但對(duì)平均醉倒時(shí)間隨篩選天數(shù)的變化趨勢(shì)無(wú)影響?？梢?jiàn)，代謝酶本身不是醉酒抗性形成的機(jī)制，而僅僅微調(diào)抗性的幅度。取食含酶抑制劑的黑腹果蠅雌蠅和雄蠅若每天接受甲醇熏蒸處理，死亡率顯著提高。雄蠅死亡率從空白對(duì)照和取食含丙酮飼料的約2％提高到10％以上，雌蠅死亡率也從對(duì)照的約5

10、％提高到10％以上。據(jù)此我們推論，甲醇代謝酶也可能存在于神經(jīng)系統(tǒng)周邊組織甚至神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，移除甲醇，從而降低甲醇的神經(jīng)毒性。
　　 5.醇類誘導(dǎo)的雄蠅同性求偶行為黑腹果蠅雄蟲(chóng)經(jīng)歷每天1次的甲醇或乙醇重復(fù)誘導(dǎo)后，解除了性抑制，表現(xiàn)出積極的同性求偶行為。選擇了果蠅神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)信號(hào)途徑相關(guān)的8個(gè)基因的果蠅突變品系。發(fā)現(xiàn)Shc、drk、csw、Pi3k21B和RhoGDI編碼基因被突變后，即使在甲醇的誘導(dǎo)下，突變品系果蠅也不表現(xiàn)出同性求偶行為

11、;然而Rho1編碼基因被突變后，果蠅表現(xiàn)出了較高的同性求偶行為?？梢?jiàn)，Shc、drk、csw、Pi3k21B、Rho1及RhoGDI介導(dǎo)了甲醇誘導(dǎo)的黑腹果蠅雄蟲(chóng)同性求偶行為。據(jù)此我們認(rèn)為，每天1次的甲醇重復(fù)誘導(dǎo)通過(guò)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)信號(hào)途徑重塑了神經(jīng)回路，從而導(dǎo)致了雄蠅行為的改變。
　　 6.黑腹果蠅對(duì)甲醇的趨性水果發(fā)酵過(guò)程中，碳水化合物分解產(chǎn)生醇類揮發(fā)物，而蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生一系列揮發(fā)性的含氮化合物。利用Y型嗅覺(jué)儀分別測(cè)試了黑腹果蠅雌蟲(chóng)和雄

12、蟲(chóng)在饑餓/飽食狀態(tài)、交配/不交配狀態(tài)下對(duì)甲醇、乙醇和氨的嗅覺(jué)行為反應(yīng)。結(jié)果顯示，交配和饑餓并不顯著改變果蠅對(duì)甲醇和乙醇的趨性，而明顯增加了果蠅對(duì)碳酸氫氨的選擇偏好性。交配和饑餓也促進(jìn)了黑腹果蠅成蠅的擴(kuò)散行為。雙向選擇性產(chǎn)卵實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，野生CS品系雌蟲(chóng)避免在含有甲醇和乙醇的飼料上的產(chǎn)卵，而偏愛(ài)在含有碳酸氫氨和硫化鉀的飼料上產(chǎn)卵?；蛲蛔兤废祵?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Or83b和Nc73EF編碼基因被突變的雌蟲(chóng)不表現(xiàn)產(chǎn)卵偏好性，在醇類和胺類物質(zhì)上的產(chǎn)