馬圓線蟲COI和nad1序列測定及系統(tǒng)發(fā)育分析.pdf

1、圓線蟲是馬屬動物體內(nèi)最重要的寄生蟲，嚴重危害宿主的健康，使其患病乃至死亡，對畜牧養(yǎng)殖業(yè)造成較大損失。大量使用驅(qū)蟲藥使盅口線蟲出現(xiàn)抗藥性，增加了患病率。馬屬動物寄生圓線蟲的分類鑒定和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究，對于有針對性地控制圓線蟲病具有重大意義。目前，國外學(xué)者為圓線蟲的研究提供了豐富的數(shù)據(jù)資料，國內(nèi)對于圓線蟲的研究較少，且主要是形態(tài)學(xué)方面的研究，缺乏相關(guān)分子資料。本研究以采自河南新鄉(xiāng)地區(qū)的35種圓線蟲為研究對象，經(jīng)光學(xué)顯微鏡初步鑒定后，通過PCR

2、技術(shù)擴增其線粒體COⅠ和nad1基因，探究馬圓線蟲的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。35種圓線蟲的擴增產(chǎn)物經(jīng)測序共獲得39條COⅠ序列和32條nad1序列。通過使用多種生物學(xué)軟件，對所得目的片段進行了堿基組成、遺傳距離等分析。采用最大似然法(ML)和貝葉斯法(BI)分別基于COⅠ和nad1序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并且構(gòu)建基于COⅠ和nad1聯(lián)合數(shù)據(jù)集的系統(tǒng)樹。發(fā)現(xiàn)BI法更適合馬圓線蟲的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴所測樣品的COⅠ序列長度

3、均為393 bp，通過多序列比對顯示，其中保守位點、變異位點、簡約信息位點、單核苷酸位點分別占總位點的64.63％、35.37％、29.52％、5.85％。A+T平均含量(67.3％)明顯高于G+C(32.7％)，表現(xiàn)出明顯的AT堿基偏好性。從氨基酸密碼子來看，第三位點的A+T平均含量最高(78.6％)，第二位點(63.1％)稍高于第一位點(61.2％)。轉(zhuǎn)換和顛換比值R最大的是第1密碼子位點，其次是第3密碼子位點，進化最快，第2密碼子

4、位點沒有發(fā)生堿基替換，進化最慢?；贑OⅠ序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹顯示，種內(nèi)個體均聚為獨立分支，對于屬以上分類階元的區(qū)分結(jié)果不夠理想，但仍有一定的參考價值。⑵測序所得32條nad1序列的總長度均為354 bp，對序列進行多序列比對分析，其中保守位點218個，變異位點136個，簡約信息位點115個，單核苷酸位點21個。A、C、G、T四種堿基的平均含量為25.4％、9.8％、21.7％、43.1％，A+T平均含量(68.5％)明顯高于G+C(31.

5、4％)，表現(xiàn)出AT堿基偏倚性。就氨基酸密碼子來看，A+T平均含量最高(74.2％)的是第3位點，第1位點(66.1％)和第2位點(65.1％)相差不大。三個密碼子位點的轉(zhuǎn)換和顛換比值R最小的為第3密碼子位點，進化最快，其次是第1密碼子位點，第2密碼子位點的R值最大，進化速率最慢。在構(gòu)建的系統(tǒng)樹中，31種圓線蟲形成兩大類群:一個大類群包括圓形屬、三齒屬和卡拉干斯齒線蟲、不等齒杯口線蟲以及伊氏雙齒口線蟲;另一大類群包括杯冠屬、杯環(huán)屬、冠環(huán)屬

6、、盅口屬和杯狀彼得洛夫線蟲、拉氏杯口線蟲、雙冠雙冠線蟲、頭似輔首線蟲。其中冠環(huán)屬、盅口屬和杯冠屬的親緣關(guān)系較近;長形杯環(huán)線蟲和外射杯環(huán)線蟲與杯環(huán)屬的親緣關(guān)系較遠?；贑OⅠ+nad1序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹拓撲結(jié)構(gòu)與之類似，僅支持率存在差異。采用ML法重建圓線蟲的系統(tǒng)進化關(guān)系自展支持率較低，BI法構(gòu)建的系統(tǒng)樹支持率高，說明依據(jù)COⅠ和nad1序列進行圓線蟲的系統(tǒng)發(fā)育分析時，BI法更加適合。⑶在河南省發(fā)現(xiàn)卡拉干斯齒線蟲（Skrjabinode

7、ntus caragandicus），對其進行了形態(tài)學(xué)觀察和分子序列測定與分析。結(jié)果表明:卡拉干斯齒線蟲中等大小，口囊壁呈“S”狀，前端極度膨大，厚10～12μm，后端稍薄，約4～6μm，外葉冠由8個長而寬的小葉組成，內(nèi)葉冠由16～18個短而寬的小葉組成，食道漏斗發(fā)達，雄蟲生殖錐長337μm，引器長245μm;所測核糖體DNA(rDNA)內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)及5.8S片段長度為853 bp，其中ITS1長369 bp，ITS2長331