α2巨球蛋白在文昌魚受精卵中的存在及其抑菌作用分析——頭索動(dòng)物母源性免疫新證據(jù).pdf

1、與哺乳動(dòng)物相比，大多數(shù)水生動(dòng)物將其卵子釋放到充滿病原菌的水環(huán)境中，并且在水中完成受精以及進(jìn)行胚胎發(fā)育。那么發(fā)育中的胚胎在自身免疫系統(tǒng)成熟之前是怎樣保護(hù)自身免受病菌的侵害呢？這是一個(gè)非常有意義的問題，但是依然沒有很好的得到解決。
　　在魚類中，已經(jīng)證明許多母源性免疫因子可以通過不同的作用模式來為早期發(fā)育中的胚胎提供保護(hù)。無脊椎動(dòng)物缺乏產(chǎn)生抗體的能力，但是在一些物種也發(fā)現(xiàn)了被動(dòng)免疫的母體傳遞現(xiàn)象。但是，對于無脊椎動(dòng)物的母源性免疫尤其是

2、母源性免疫組分的研究數(shù)據(jù)非常有限。
　　α2巨球蛋(alpha2 macroglobulin，A2m)是一種廣譜性蛋白酶抑制劑，能夠抑制內(nèi)源性的或者來自入侵病菌的外源性蛋白酶，被認(rèn)為是進(jìn)化過程中天然免疫系統(tǒng)中的保守組成部分。頭索動(dòng)物文昌魚是現(xiàn)存的與脊椎動(dòng)物親緣關(guān)系最近的無脊椎動(dòng)物。已有實(shí)驗(yàn)證明在文昌魚的卵巢中檢測到了A2m mRNA的表達(dá)，這使我們設(shè)想A2m是否會(huì)作為一個(gè)母源性的免疫因子存在于受精卵中，并且在胚胎早期發(fā)育過程中發(fā)揮

3、防御功能？基于如上，我們首先檢測文昌魚的卵液是否能有效抑制細(xì)菌的生長，如果能夠，則驗(yàn)證A2m是否作為一種母源性免疫因子存在于受精卵中，并且參與卵液的抑菌作用。
　　在本研究中，我們首先制備了的1-2cell時(shí)期文昌魚受精卵卵液，并進(jìn)行了抑菌實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，文昌魚的卵液能夠有效的抑制大腸桿菌(E.coli，革蘭氏陰性菌)和金黃色葡萄球菌(S.aureus，革蘭氏陽性菌)的生長，而且其抑菌活性與卵液的濃度有明顯的相關(guān)性。
　　其

4、次，利用基因克隆、原核表達(dá)技和蛋白分離純化技術(shù)獲得了文昌魚A2m重組蛋白，并用純化后的A2m重組蛋白作為抗原對新西蘭兔子進(jìn)行免疫注射，制備了抗A2m的抗血清。為了鑒定A2m是否存在于文昌魚的受精卵中，則將卵液進(jìn)行了SDS-PAGE電泳，分別用商業(yè)化的抗-人A2m抗體和自制的抗-文昌魚A2m抗血清進(jìn)行了免疫印跡(Western blotting)檢測，結(jié)果分別獲得一條分子量約為170kDa的陽性條帶，這與文昌魚A2m相對分子量大小相一致。

5、這充分證明了A2m作為一種母源性免疫因子存在于頭索動(dòng)物文昌魚受精卵中。
　　在文昌魚受精卵中，母源性的A2m除了以蛋白形式存在之外，是否也存在其mRNA呢？因此，我們利用地高辛標(biāo)記的A2m RNA探針對1-4細(xì)胞時(shí)期胚胎進(jìn)行了原位雜交，結(jié)果在受精卵中檢測到了明顯的陽性信號。這說明了受精卵中存在母源性的A2m mRNA。進(jìn)一步，我們利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對不同發(fā)育時(shí)期胚胎的A2m表達(dá)水平進(jìn)行了分析。發(fā)現(xiàn)，1-4細(xì)胞時(shí)期中mRNA的豐

6、度最高。這與原位雜交結(jié)果相互印證，充分證明了母源性A2m mRNA存于文昌魚卵子中。因此，A2m作為母源性免疫因子以蛋白和mRNA兩種形式并存于文昌魚受精卵中。
　　為了探索母源性的A2m是否在卵液抑菌活性中發(fā)揮作用，我們又進(jìn)行了一系列的實(shí)驗(yàn)。首先，當(dāng)利用抗體沉淀A2m后，發(fā)現(xiàn)卵液對大腸桿菌和葡萄球菌的抑菌活性發(fā)生明顯降低。這說明，母源性的A2m在一定程度上參與了卵液的抑菌作用。此外，研究還發(fā)現(xiàn)重折疊的A2m重組蛋白可以抑制大腸桿

7、菌和金黃色葡萄球菌的生長，并呈現(xiàn)出一定的濃度依賴性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，利用FITC熒光素標(biāo)記的A2m蛋白可以與大腸桿菌進(jìn)行有效地結(jié)合。除此之外，通過掃描電鏡技術(shù)研究了A2m和大腸桿菌的相互作用，發(fā)現(xiàn)A2m能夠使大腸桿菌細(xì)胞發(fā)生皺縮，甚至破壞它們的結(jié)構(gòu)。這些數(shù)據(jù)表明，母源性的A2m在卵液的抑菌中發(fā)揮了重要作用，可能直接作用于細(xì)菌。
　　綜上所述，頭索動(dòng)物文昌魚的卵液具有抑菌活性。其中，A2m作為一種重要的母源性免疫因子存在于受精卵中，