外周神經(jīng)損傷對(duì)DRG和脊髓神經(jīng)細(xì)胞GIRK家族蛋白表達(dá)的影響.pdf

1、傷害性神經(jīng)元興奮性的增強(qiáng)是慢性疼痛發(fā)生和發(fā)展的基礎(chǔ)。多種離子通道，包括鈉離子通道、鈣離子通道和鉀離子通道在控制神經(jīng)元的興奮性上起到重要作用。G蛋白門(mén)控內(nèi)向整流鉀離子（GIRK）通道已被證實(shí)能夠調(diào)控神經(jīng)元的興奮性。此前的研究報(bào)道GIRK通道四個(gè)亞單位的mRNA在大鼠和人類背根神經(jīng)節(jié)（DRG）中均有所表達(dá)。功能性的GIRK通道是由其亞單位成員中的一個(gè)或兩個(gè)組成的同源四聚體或異源四聚體。GIRK通道通過(guò)與抑制性G蛋白偶聯(lián)受體（G protei

2、n coupled receptors，GPCRs）的相互作用而被激活并開(kāi)放，鉀離子外流，使膜電位變得更“負(fù)”，從而降低神經(jīng)元的興奮性。本論文旨在系統(tǒng)地研究GIRK通道亞單位在正常大鼠DRG和脊髓中表達(dá)的神經(jīng)化學(xué)特性，以及通過(guò)構(gòu)建外周神經(jīng)損傷的大鼠神經(jīng)病理性疼痛模型研究外周神經(jīng)損傷對(duì)GIRK通道四個(gè)亞單位的表達(dá)調(diào)控，分析和闡述GIRK通道在神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生和發(fā)展中所起到的作用。
　　本研究利用免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)和定量分析等方法確定

3、了GIRK通道亞單位在正常大鼠腰椎4-5（L4-5）節(jié)段DRG組織和L5脊髓組織中的表達(dá)和分布情況。在正常大鼠DRG中~70％和<10%的神經(jīng)元分別表達(dá)GIRK1和GIRK2。利用降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）、植物凝集素B4（IB4）和神經(jīng)絲蛋白-200（NF200）抗體分別標(biāo)記DRG中的小型無(wú)髓鞘肽能神經(jīng)元、小型無(wú)髓鞘非肽能神經(jīng)元和中大型有髓鞘神經(jīng)元，激光共聚焦共定位研究結(jié)果表明GIRK1和GIRK3廣泛地表達(dá)于這三種神經(jīng)元類群，而G

4、IRK2僅表達(dá)于CGRP和NF200陽(yáng)性神經(jīng)元類群。進(jìn)一步使用四種鈣離子結(jié)合蛋白鈣結(jié)合蛋白D28k（CB）、鈣視網(wǎng)膜蛋白（CR）、小清蛋白（PV）和促泌素蛋白（Scgn）抗體標(biāo)記不同的DRG神經(jīng)元類群，對(duì)GIRK通道亞單位的表達(dá)特性進(jìn)行進(jìn)行地分析，結(jié)果表明GIRK1與四種鈣離子結(jié)合蛋白均存在不同程度上的共定位關(guān)系，而GIRK2只在CB陽(yáng)性神經(jīng)元中表達(dá)。為分析GIRK1~4在脊髓背角中的表達(dá)特性，使用不同的標(biāo)記物分別標(biāo)記DRG神經(jīng)元軸突在

5、脊髓背角投射末端分布的薄層（lamina），其中，GIRK1和GIRK2主要表達(dá)于lamina Ⅱ，GIRK3和GIRK4主要表達(dá)于lamina I和外層lamina Ⅱ。此外，GIRK1~4與VGLUT1或VGLUT2的共定位研究結(jié)果表明GIRK1~4在脊髓背角存在突觸前膜定位。利用神經(jīng)元標(biāo)記物NeuN標(biāo)記脊髓背角神經(jīng)元，結(jié)果表明GIRK1和GIRK2廣泛地表達(dá)于不同lamina區(qū)域的局部神經(jīng)元，但是GIRK3和GIRK4不表達(dá)于局部

6、神經(jīng)元。
　　為研究外周神經(jīng)損傷對(duì)GIRK通道亞單位表達(dá)調(diào)控，我們通過(guò)大鼠坐骨神經(jīng)離斷（axotomy）手術(shù)制備了外周神經(jīng)損傷引起的神經(jīng)病理性疼痛模型。通過(guò)免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)、原位雜交實(shí)驗(yàn)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)、western blot實(shí)驗(yàn)和定量分析等方法對(duì)GIRK1~4在mRNA和蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)情況進(jìn)行分析。結(jié)果表明損傷側(cè)DRG和脊髓背角中GIRK1、GIRK2和GIRK4的表達(dá)均顯著下調(diào)，而GIRK3的表達(dá)顯著上調(diào)。結(jié)合此

7、前的研究結(jié)果進(jìn)行分析，GIRK3表達(dá)的上調(diào)能夠降低神經(jīng)元細(xì)胞膜的GIRK1/2和GIRK2/2通道。
　　為研究GIRK通道亞單位在DRG神經(jīng)元中的軸突轉(zhuǎn)運(yùn)，分別利用大鼠坐骨神經(jīng)結(jié)扎（ligation）模型和脊髓神經(jīng)背根切除（rhizotomy）模型研究在DRG神經(jīng)元中合成的GIRK1~4向外周端和中樞端運(yùn)輸情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GIRK1~4均存在向外周和中樞運(yùn)輸?shù)捻樞修D(zhuǎn)運(yùn)，此外，GIRK1~3存在外周軸突末端向胞體端運(yùn)輸?shù)哪嫘修D(zhuǎn)運(yùn)

8、。利用免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步檢測(cè)了GIRK1~4在正常大鼠坐骨神經(jīng)和后爪無(wú)毛皮膚中的表達(dá)和分布，結(jié)果表明GIRK1~4廣泛地表達(dá)于包括感覺(jué)纖維在內(nèi)的多種類群的神經(jīng)纖維，且GIRK1~4均表達(dá)于后爪無(wú)毛皮膚真皮層中的神經(jīng)末端。
　　綜上所述，本研究首次系統(tǒng)地闡述了GIRK通道四種亞單位在大鼠DRG和脊髓中表達(dá)的神經(jīng)化學(xué)特性，并通過(guò)外周神經(jīng)損傷模型和多種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法證明了GIRK通道在神經(jīng)病理性疼痛情況下的表達(dá)下調(diào)。GIRK通