IA型磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)及相關(guān)蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)構(gòu)與功能的研究.pdf

1、蛋白質(zhì)是生物體內(nèi)各種功能的直接執(zhí)行者，大多數(shù)重要的細(xì)胞生命過程的執(zhí)行與完成，都是由蛋白質(zhì)，特別是蛋白質(zhì)復(fù)合物調(diào)節(jié)控制。蛋白質(zhì)復(fù)合物大多是由大量獨(dú)特的蛋白質(zhì)組合而成的。蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)解析及功能研究是闡明細(xì)胞代謝、信號(hào)傳導(dǎo)和基因表達(dá)等重要生命過程的關(guān)鍵步驟環(huán)節(jié)。因此，對(duì)蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)解析和功能研究具有生物學(xué)和治療學(xué)的雙重意義和價(jià)值。
　　 磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3Ks)是一種磷酸化磷脂酰肌醇4，5-二磷酸

2、鹽肌醇環(huán)上3號(hào)位的脂質(zhì)激酶，由此產(chǎn)生的磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸鹽在一系列信號(hào)傳導(dǎo)過程中發(fā)揮著重要的作用。PI3Ks由三種不同結(jié)構(gòu)和功能的酶構(gòu)成(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)，其中IA型PI3K是有兩個(gè)亞基組成的異二聚體。催化亞基p110有三個(gè)異形體:α、β、δ，其中α和β異形體大量存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中;調(diào)節(jié)亞基(p85α、p85β、p55α、p50α、p55γ)與p110形成穩(wěn)定的二聚體，以保證其熱穩(wěn)定性并抑制其活性。目前，雖然已有部分片段的結(jié)構(gòu)報(bào)

3、道，IA型PI3K的整體結(jié)構(gòu)仍舊未知。因此其調(diào)節(jié)亞基和催化亞基各自的結(jié)構(gòu)仍需進(jìn)一步研究，p85二聚體的結(jié)構(gòu)也需進(jìn)行研究，這樣才能更好地解析蛋白質(zhì)復(fù)合物p85/p110的整體結(jié)構(gòu)。
　　 同時(shí)，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與其功能存在著一定的關(guān)聯(lián)，觀察其結(jié)構(gòu)的變化有助于推斷分析對(duì)其功能的影響。因此，建立構(gòu)效關(guān)系研究方法有助于深入了解蛋白質(zhì)的作用并促進(jìn)其結(jié)構(gòu)研究進(jìn)展。
　　 本論文以分析化學(xué)、環(huán)境毒理學(xué)為背景，結(jié)合高效液相色譜、質(zhì)譜等實(shí)驗(yàn)技

4、術(shù)，利用γ射線產(chǎn)生羥基自由基對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行氧化標(biāo)記，并結(jié)合現(xiàn)代生物技術(shù)和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)來解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu);結(jié)合光譜技術(shù)和分子對(duì)接模擬方法，對(duì)選定的功能蛋白酶進(jìn)行蛋白質(zhì)功能（酶活性）的研究。論文主要包括以下五個(gè)部分的內(nèi)容:
　　 論文的第一章概述了蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)情況;闡述了磷脂酰肌醇-3-激酶的構(gòu)成和功能以及目前對(duì)其結(jié)構(gòu)研究的現(xiàn)狀和進(jìn)展;介紹了蛋白質(zhì)氧化標(biāo)記分析技術(shù)、蛋白質(zhì)分離和鑒定技術(shù)以及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析等多種技術(shù)手段。在文獻(xiàn)

5、綜述的基礎(chǔ)上分析了目前研究中存在的問題和需要調(diào)整之處，并提出利用γ射線照射產(chǎn)生羥基自由基對(duì)蛋白質(zhì)復(fù)合物形成前后蛋白質(zhì)氨基酸側(cè)鏈進(jìn)行氧化標(biāo)記、聯(lián)合蛋白酶解和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)解析p85/p110α的結(jié)構(gòu)的方法。
　　 論文的第二章選擇p85兩個(gè)相連的結(jié)構(gòu)域片段——nSH2-iSH2進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析:對(duì)nSH2片段和nSH2-iSH2片段設(shè)置不同的暴露照射時(shí)間進(jìn)行羥基自由基氧化標(biāo)記，使用胰蛋白酶分別將氧化標(biāo)記的蛋白酶解，對(duì)nSH

6、2和nSH2-iSH2酶解產(chǎn)物進(jìn)行液相色譜分離、質(zhì)譜分析檢測(cè)，確定氧化標(biāo)記程度，并對(duì)同一個(gè)肽氧化標(biāo)記前后的標(biāo)記程度進(jìn)行比較，最終確定氧化標(biāo)記程度降低的多肽為nSH2和iSH2的結(jié)合位置——多肽(351-360)DTADGTFLVR、(392-426)YGFSDPLTFSSVVELINHYR和(426-436)LLYPVSK。
　　 論文的第三章解析了p85二聚體p85-p85的結(jié)構(gòu)，解析方法與上一章相似。通過酶解氧化標(biāo)記的p85

7、單體和p85二聚體，并利用液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)作為主要檢測(cè)技術(shù)，定性、定量檢測(cè)氧化標(biāo)記前后同一個(gè)肽在單體和二聚體中氧化標(biāo)記程度的變化，最終確定p85二聚體的結(jié)合位置位于SH3和BCR區(qū)域，具體涉及多肽(21-36)EEDIDLHLGDILTVNK、(37-68)GSLVALGFSDGQEARPEEIGWLNGYNETTGER、(106-136)TEADVEQQALTLPDLAEQFAPPDIAPPLLIK和(137-143)LVEAI

8、EK等幾個(gè)位點(diǎn)。
　　 論文的第四章利用光譜學(xué)方法探索蛋白質(zhì)的構(gòu)效關(guān)系，重點(diǎn)研究其結(jié)構(gòu)變化對(duì)功能的影響。在模擬生理的條件下，選取對(duì)蛋白質(zhì)可能產(chǎn)生毒性影響的物質(zhì)（本文選取一種持久性有機(jī)污染物——農(nóng)藥三氯殺螨醇）和功能蛋白（兩種絲氨酸蛋白酶——胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶），利用紫外吸收光譜、熒光光譜和同步熒光光譜等光譜學(xué)技術(shù)手段定性定量地研究小分子化合物對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的影響及其作用機(jī)理，進(jìn)而分析結(jié)構(gòu)變化所引起的蛋白質(zhì)功能的改變，

9、并通過分子模擬等手段具體分析作用位點(diǎn)、作用力等相互作用信息。通過多種技術(shù)方法檢測(cè)和分析，確定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化對(duì)其功能的影響，建立研究蛋白質(zhì)構(gòu)效關(guān)系的光譜學(xué)方法。
　　 論文的第五章對(duì)本文的三個(gè)研究主體部分進(jìn)行了總結(jié)論述，并對(duì)這種新的解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的方法做了展望。
　　 本研究豐富了蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)構(gòu)解析的方法，評(píng)價(jià)了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化對(duì)其功能的影響，有助于蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域的研究與發(fā)展，并為相關(guān)疾病的預(yù)防、早期診斷和治