米曲霉β-半乳糖苷酶的基因克隆與酶學(xué)特征分析.pdf

1、β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，EC3.2.1.23)是普遍存在的酶，能夠水解二糖、復(fù)合糖及多糖的末端β-D-半乳糖基部分。β-半乳糖苷酶屬于水解酶，并且在明確的反應(yīng)條件下可以催化轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)合成低聚半乳糖(GOS)。β-半乳糖苷酶可將牛乳和乳制品中的主要糖成分乳糖水解為半乳糖和葡萄糖，用于治療人體內(nèi)缺乏乳糖酶而引起的乳糖不耐受癥。β-半乳糖苷酶的應(yīng)用范圍從分析研究到糖重構(gòu)學(xué)，并廣泛應(yīng)用于生物、醫(yī)藥等領(lǐng)域。2015年米曲霉

2、RIB40基因組的公布，使得研究全基因組下β-半乳糖苷酶系成為可能。通過分析米曲霉基因組序列信息，發(fā)現(xiàn)其基因組中至少有4個編碼β-半乳糖苷酶的基因序列，但它們之間的生化活力與功能差異性等方面未知。為此，本研究通過分子克隆技術(shù)將米曲霉β-半乳糖苷酶系進(jìn)行克隆表達(dá)，并就其生化特征與黑曲霉來源的β-半乳糖苷酶系進(jìn)行比較分析，以期較為系統(tǒng)的比較其異同屬性，為開發(fā)新一代β-半乳糖苷酶產(chǎn)品，并實(shí)現(xiàn)其大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)與應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下:

3、r>　　通過PCR技術(shù)擴(kuò)增米曲霉F1005F3個β-半乳糖苷酶的基因O158、AO及O76，在構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC-O158、pPIC-AO及pPIC-O76的基礎(chǔ)上，構(gòu)建并通過His+篩選及G418抗性篩選，獲得了分泌表達(dá)β-半乳糖苷酶的重組巴斯德畢赤氏酵母GS115(pPIC-O158)、GS115(pPIC-AO)、GS115(pPIC-O76)。對重組酵母進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，在0.5％(v/v)甲醇誘導(dǎo)條件下發(fā)酵120 h，能夠分

4、泌表達(dá)β-半乳糖苷酶。
　　本研究進(jìn)一步對三個重組酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了分析，重組β-半乳糖苷酶O158、AO及O76的最適作用pH分別為4.0、5.5、7.0;最適作用溫度均為50℃;在pH4.5-7.5之間和低于40℃均具有良好穩(wěn)定性;Mn2+對重組β-半乳糖苷酶O158、AO和O76有明顯的激活作用，F(xiàn)e2+及Cu2+有明顯的抑制作用;以乳糖為底物采用雙倒數(shù)作圖法測得O158、AO和O76的Km分別是5.48 mmol/L、5.