比色分析及分光光度法

1、1,第 七 章比色分析及分光光度法Colorimetry and Spectrophotometry,分析化學(xué),2,基本內(nèi)容和重點(diǎn)要求,掌握物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收、吸光度和透光度、朗伯—比爾定律及摩爾吸光系數(shù)等知識(shí)了解比色分析和分光光度法的特點(diǎn)、基本原理、儀器構(gòu)造和各部件的作用學(xué)習(xí)掌握顯色反應(yīng)和顯色條件的選擇理解掌握 分光光度法定量分析中的各種影響因素,3,本章內(nèi)容提要,§7.1 概述§7.2 物質(zhì)對(duì)

2、光的選擇性吸收§7.3 光吸收基本定律§7.4 比色分析和分光光度法及其儀器,4,§7.1 概述,方法依據(jù)及分類方法特點(diǎn),5,一、方法依據(jù)及分類,基于物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收而建立起來的分析方法，包括比色法、可見?及紫外光度法及紅外光譜法等。比色分析法：通過目視比較顏色的深淺來測(cè)定物質(zhì)的濃度。分光光度法：使用分光光度計(jì)測(cè)定的方法。,6,二、分光光度法的特點(diǎn),靈敏度高、選擇性好準(zhǔn)確度較高應(yīng)用廣

3、泛儀器簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便、分析快速,7,§7.2 物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收,光的基本性質(zhì)物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收,8,一、光的基本性質(zhì),光的波動(dòng)性和微粒性：,,,9,2. 電磁波譜圖,10,3. 單色光與復(fù)合光,單色光：具有同一波長(zhǎng)的光復(fù)合光：不同波長(zhǎng)組成的光可見光的波長(zhǎng)大約在400～760nm之間，由紅、橙、黃、綠、青、藍(lán)、紫等各種色光按一定比例混合而成，各種光具有一定的波長(zhǎng)范圍。,11,4. 互補(bǔ)光,12,二、物質(zhì)對(duì)光

4、的選擇性吸收,13,1. 物質(zhì)顏色和吸收顏色的關(guān)系,14,2. 吸收光譜圖,最大吸收波長(zhǎng)?max,15,3. 分析依據(jù),定性分析：最大吸收波長(zhǎng)?max定量分析：吸光度大小,16,§7.3 光吸收基本定律,透光率與吸光度朗伯－比爾定律吸光系數(shù)、摩爾吸光系數(shù)吸光度的加合性標(biāo)準(zhǔn)曲線（校正曲線）,17,一、透光率與吸光度,透光率或透射比,吸光度,Transmittance and absorptivity,18,,∞

5、,透光率T與吸光度A的關(guān)系,19,,二、朗伯—比爾定律,Lambert-Beer’s Law,A－吸光度K－比例常數(shù)，與吸光物質(zhì)的性質(zhì)、入射光波長(zhǎng)、溫度等有關(guān)b－液層厚度，cmc－溶液的濃度，mol?L-1或g ?L-1,20,三、吸光系數(shù)、摩爾吸光系數(shù),吸光系數(shù)a：摩爾吸光系數(shù)?：關(guān)系： e＝ M a,,21,例 1,50mL比色管中，加入含有0.025mg的Fe2+溶液，加入鄰二氮菲顯色劑，用水稀釋至50mL，用

6、2cm比色池，在分光光度計(jì)上測(cè)得吸光度A=0.190，計(jì)算摩爾吸光系數(shù)?？解：,22,四、吸光度的加合性,多組分體系中,23,Standard curve，calibrated curve，working curve,五、標(biāo)準(zhǔn)曲線（校正曲線）,24,§7.4 比色分析和分光光度法及其儀器,目視比色法分光光度法,25,一、目視比色法（ colorimetry ）,方法依據(jù)方法特點(diǎn),,,方便、靈敏，準(zhǔn)確度差。常用于限界分

7、析。,26,二、分光光度法,Spectrophotometry,27,分光光度計(jì),基本部件,28,,光源：在可見光和近紅外光區(qū)，常用鎢燈或碘鎢燈作光源，它們輻射320－2500nm波長(zhǎng)的光；在近紫外區(qū)，常使用氫燈或氘燈，它們能輻射180－375nm波長(zhǎng)的光。,29,,單色器：棱鏡－用光學(xué)玻璃或石英制成。光柵－光通過光柵發(fā)生衍射和干涉現(xiàn)象而分光。,30,棱鏡：依據(jù)不同波長(zhǎng)光通過棱鏡時(shí)折射率不同,單色器,31,光柵：在鍍鋁的玻璃表面刻

8、有數(shù)量很大的等寬度等間距條痕(600、1200、2400條/mm )。,原理：利用光通過光柵時(shí)發(fā)生衍射和干涉現(xiàn)象而分光.,32,,吸收池：由無(wú)色透明的光學(xué)玻璃或石英制成。檢測(cè)器：硒光電池、光電管或光電倍增管。顯示系統(tǒng)：檢流計(jì)、記錄儀、數(shù)字顯示器、電腦等,33,檢測(cè)器,硒光電池,Ag、Au,34,光電管,紅敏管 625-1000 nm藍(lán)敏管 200-625 nm,35,光電倍增管,待掃描,160-700 nm,1個(gè)光電子可

9、產(chǎn)生106～107個(gè)電子,36,雙光束和雙波長(zhǎng)分光光度計(jì) 工作原理,37,§7.2 光度分析法的設(shè)計(jì),顯色反應(yīng)顯色條件的選擇測(cè)量波長(zhǎng)和吸光度范圍的選擇參比溶液的選擇標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作,38,一、顯色反應(yīng),Color reaction待測(cè)物質(zhì)本身有較深的顏色，直接測(cè)定；待測(cè)物質(zhì)是無(wú)色或很淺的顏色，需要選適當(dāng)?shù)脑噭┡c被測(cè)離子反應(yīng)生成有色化合物再進(jìn)行測(cè)定，此反應(yīng)稱為顯色反應(yīng)，所用的試劑稱為顯色劑（color reagent）

10、。按顯色反應(yīng)的類型來分，主要有氧化還原反應(yīng)和絡(luò)合反應(yīng)兩大類，而絡(luò)合反應(yīng)是最主要的。,39,,顯色反應(yīng)的選擇 選擇性好，干擾少，或干擾容易消除；靈敏度高，有色物質(zhì)的ε應(yīng)大于104。有色化合物的組成恒定，符合一定的化學(xué)式。有色化合物的化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，至少保證在測(cè)量過程中溶液的吸光度基本恒定。這就要求有色化合物不容易受外界環(huán)境條件的影響。有色化合物與顯色劑之間的顏色差別要大，即顯色劑對(duì)光的吸收與絡(luò)合物的吸收有明顯區(qū)別，要求兩者的吸收峰

11、波長(zhǎng)之差Δλ（稱為對(duì)比度）大于60 nm。,40,,顯色劑無(wú)機(jī)顯色劑不多，因?yàn)樯傻慕j(luò)合物不穩(wěn)定，靈敏度和選擇性也不高。如用KSCN顯色測(cè)鐵、鉬、鎢和鈮；用鉬酸銨顯色測(cè)硅、磷和釩等。有機(jī)顯色劑分子中含有生色團(tuán)和助色團(tuán)。生色團(tuán)（chromophoric group）：某些含不飽和鍵的基團(tuán)，如偶氮基、對(duì)醌基和羰基等。這些基團(tuán)中的π電子被激發(fā)時(shí)需能量較小，可吸收波長(zhǎng)200nm以上的可見光而顯色。助色團(tuán)（auxochromic grou

12、p）：含孤對(duì)電子的基團(tuán)，如氨基、羥基和鹵代基等。這些基團(tuán)與生色團(tuán)上的不飽和鍵作用，使顏色加深。,41,,有機(jī)顯色劑多元絡(luò)合物三元混配絡(luò)合物離子締合物金屬離子－絡(luò)合劑－表面活性劑體系雜多酸,42,,有機(jī)顯色劑磺基水楊酸：OO型螯合劑，可與很多高價(jià)金屬離子生成穩(wěn)定的螯合物，主要用于測(cè)Fe3+。丁二酮肟：NN型螯合劑，用于測(cè)定Ni2+。1,10-鄰二氮菲：NN型螯合劑，測(cè)微量Fe2+。二苯硫腙：含S顯色劑，萃取光度測(cè)定Cu2

13、+、Pb2+、Zn2+、Cd2+、Hg2+等。偶氮胂Ⅲ(鈾試劑Ⅲ)：偶氮類螯合劑，強(qiáng)酸性溶液中測(cè)Th(Ⅳ)、Zr(Ⅳ)、U(Ⅳ)等；在弱酸性溶液中測(cè)稀土金屬離子。鉻天青S：三苯甲烷類顯色劑，測(cè)定Al3+。結(jié)晶紫：三苯甲烷類堿性染料，測(cè)定Tl3+。,43,,多元絡(luò)合物多元絡(luò)合物是由三種或三種以上的組分所形成的絡(luò)合物。目前應(yīng)用較多的是由一種金屬離子與兩種配位體所組成的三元絡(luò)合物。三元絡(luò)合物在吸光光度分析中應(yīng)用較普遍。三元混配絡(luò)合物

14、：金屬離子與一種絡(luò)合劑形成未飽和絡(luò)合物，然后與另一種絡(luò)合劑結(jié)合，形成三元混合配位絡(luò)合物，簡(jiǎn)稱三元混配絡(luò)合物。例如，V(V)，H2O2和吡啶偶氮間苯二酚(PAR)形成1:1:1的有色絡(luò)合物，可用于釩的測(cè)定，其靈敏度高，選擇性好。,44,,2. 離子締合物：金屬離子先與絡(luò)合劑生成絡(luò)陰離子或絡(luò)陽(yáng)離子，再與帶反電荷的離子生成離子締合物。主要用于萃取光度法。 如：Ag+與1,10-鄰二氮菲形成陽(yáng)離子，再與溴鄰苯三酚紅的陰離子形成深藍(lán)色的離子

15、締合物。用F-、H2O2、EDTA作掩蔽劑，可測(cè)定微量Ag+。作為離子締合物的陽(yáng)離子，有堿性染料、1,10-鄰二氮菲及其衍生物、安替比林及其衍生物、氯化四苯砷(或磷、銻)等；作為陰離子，有X-，SCN-，ClO4-，無(wú)機(jī)雜多酸和某些酸性染料等。,45,,3. 金屬離子－絡(luò)合劑－表面活性劑體系金屬離子與顯色劑反應(yīng)時(shí)，加入某些表面活性劑，可以形成膠束化合物，它們的吸收峰向長(zhǎng)波方向移動(dòng)（紅移），而測(cè)定的靈敏度顯著提高。目前，常用于這類反

16、應(yīng)的表面活性劑有溴化十六烷基吡啶、氯化十四烷基二甲基芐胺、氯化十六烷基三甲基銨、溴化十六烷基三甲基銨 、溴化羥基十二烷基三甲基銨、OP乳化劑。例如，稀土元素、二甲酚橙及溴化十六烷基吡啶反應(yīng)，生成三元絡(luò)合物，在pH8~9時(shí)呈藍(lán)紫色，用于痕量稀土元素總量的測(cè)定。,46,,4. 雜多酸溶液在酸性的條件下，過量的鉬酸鹽與磷酸鹽、硅酸鹽、砷酸鹽等含氧的陰離子作用生成雜多酸，作為吸光光度法測(cè)定相應(yīng)的磷、硅、砷等元素的基礎(chǔ)。雜多酸法需要還原反應(yīng)的

17、酸度范圍較窄，必須嚴(yán)格控制反應(yīng)條件。很多還原劑都可應(yīng)用于雜多酸法中。氯化亞錫及某些有機(jī)還原劑，例1-氨基-2-萘酚-4-磺酸加亞硫酸鹽和氫醌常用于磷的測(cè)定。硫酸肼在煮沸溶液中作砷鉬酸鹽和磷鉬酸鹽的還原劑?？箟难嵋彩禽^好的還原劑。,47,二、顯色條件的選擇,實(shí)驗(yàn)條件包括：溶液酸度、顯色劑用量、試劑加入順序、顯色時(shí)間、顯色溫度、有機(jī)絡(luò)合物的穩(wěn)定性及共存離子的干擾等。溶液的酸度M+HR=MR + H+影響被測(cè)金屬離子的存在狀態(tài)影響

18、顯色劑的平衡濃度和顏色影響絡(luò)合物的組成 可由pH與吸光度關(guān)系曲線確定pH范圍。,48,,,2. 顯色劑的用量M(被測(cè)組分)+R(顯色劑) =MR(有色絡(luò)合物)為使顯色反應(yīng)進(jìn)行完全，需加入過量的顯色劑。但顯色劑不是越多越好。有些顯色反應(yīng)，顯色劑加入太多，反而會(huì)引起副反應(yīng)，對(duì)測(cè)定不利。在實(shí)際工作中根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果來確定顯色劑的用量。,49,,,3. 顯色反應(yīng)時(shí)間有些顯色反應(yīng)瞬間完成，溶液顏色很快達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，并在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持不變

19、;有些顯色反應(yīng)雖能迅速完成，但有色絡(luò)合物的顏色很快開始褪色;有些顯色反應(yīng)進(jìn)行緩慢，溶液顏色需經(jīng)一段時(shí)間后才穩(wěn)定。制作吸光度-時(shí)間曲線確定適宜時(shí)間。,50,,4. 顯色反應(yīng)溫度顯色反應(yīng)大多在室溫下進(jìn)行。但是，有些顯色反應(yīng)必需加熱至一定溫度完成。5. 溶劑有機(jī)溶劑降低有色化合物的解離度，提高顯色反應(yīng)的靈敏度。如在Fe(SCN)3的溶液中加入丙酮顏色加深。還可能提高顯色反應(yīng)的速率，影響有色絡(luò)合物的溶解度和組成等。,51,,6.干擾及

20、其消除方法試樣中存在干擾物質(zhì)會(huì)影響被測(cè)組分的測(cè)定。例如干擾物質(zhì)本身有顏色或與顯色劑反應(yīng)，在測(cè)量條件下也有吸收，造成正干擾。干擾物質(zhì)與被測(cè)組分反應(yīng)或與顯色劑反應(yīng)，便顯色反應(yīng)不完全，也會(huì)造成干擾。干擾物質(zhì)在測(cè)量條件下從溶液中析出，便溶液變混濁，無(wú)法準(zhǔn)確測(cè)定溶液的吸光度。,52,,為消除以上原因引起干擾，可采取方法：控制溶液酸度加入掩蔽劑：選取的條件是掩蔽劑不與待測(cè)離子作用，掩蔽劑以及它與干擾物質(zhì)形成的絡(luò)合物的顏色應(yīng)不干擾待測(cè)離子的測(cè)定

21、。利用氧化還原反應(yīng)，改變干擾離子的價(jià)態(tài)。利用校正系數(shù)用參比溶液消除顯色劑和共存有色離子的干擾。選擇適當(dāng)?shù)牟ㄩL(zhǎng)當(dāng)溶液中存在有消耗顯色劑的干擾離子時(shí)，可通過增加顯色劑的用量來消除干擾。分離：以上方法均不奏效時(shí)，采用預(yù)分離方法。,53,三、測(cè)量波長(zhǎng)和吸光度范圍的選擇,測(cè)量波長(zhǎng)的選擇“最大吸收原則”（maximum absorption）不僅靈敏度高，且能減少或消除由非單色光引起的對(duì)朗伯-比爾定律的偏離。“吸收最大、干擾最小”

22、 在最大吸收波長(zhǎng)處有其他吸光物質(zhì)干擾測(cè)定,54,選擇測(cè)定波長(zhǎng)l2 ？還是l3？選擇原則：靈敏度高，測(cè)量準(zhǔn)確，干擾少。,55,,吸光度范圍的選擇從儀器測(cè)量誤差的角度來看，為使測(cè)量結(jié)果得到較高的準(zhǔn)確度，一般應(yīng)控制標(biāo)準(zhǔn)溶液和被測(cè)試液的吸光度在0.2~0.8范圍內(nèi)?？赏ㄟ^控制溶液的濃度（如改變?cè)嚇拥娜恿炕蚋淖冿@色體系的體積）或選擇不同厚度的吸收池來達(dá)到目的。,56,四、參比溶液的選擇,參比溶液作用：調(diào)節(jié)儀器的零點(diǎn)，消除由吸收池壁及溶劑

23、對(duì)入射光的反射和吸收帶來的誤差，扣除干擾的影響。 即將參比溶液裝入光學(xué)性質(zhì)相同，厚度相同的比色皿，調(diào)節(jié)儀器使透過參比皿的吸光度A參為零（T%＝100）,57,四、參比溶液的選擇,參比溶液選擇：蒸餾水：試液及顯色劑均無(wú)色。不加顯色劑的被測(cè)試液：顯色劑為無(wú)色，被測(cè)試液中存在其他有色離子。不加試樣溶液的試劑空白：顯色劑有顏色。一份試液加適當(dāng)掩蔽劑掩蔽被測(cè)組分，使之不再與顯色劑作用，而顯色劑及其他試劑均按試液測(cè)定方法加入：顯色劑

24、和試液均有顏色。改變加入試劑順序，使被測(cè)組分不顯色。,58,§7.3 光度分析法的誤差,誤差來源：偏離朗伯－比爾定律非單色光引起的偏離非平行入射光引起的偏離介質(zhì)不均勻引起的偏離由于溶液本身的化學(xué)反應(yīng)引起的偏離 測(cè)量吸光度引入的誤差吸光度A在0.2－0.8之間，測(cè)量的相對(duì)誤差較小。,59,一、偏離朗伯－比爾定律,非單色光引起的偏離目前各種分光光度計(jì)得到的入射光實(shí)際上都是具有某一波段的復(fù)合光，物質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)光的

25、吸收程度的不同，因而導(dǎo)致對(duì)朗伯－比爾定律的偏離。克服非單色光引起的偏離的措施：使用比較好的單色器人射光波長(zhǎng)選擇在被測(cè)物質(zhì)的最大吸收處測(cè)定時(shí)應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)臐舛确秶?60,,介質(zhì)不均勻引起的偏離溶液不均勻時(shí)，入射光通過溶液后，有一部分因散射現(xiàn)象而損失，使透射比減少，實(shí)測(cè)吸光度增加，使標(biāo)準(zhǔn)曲線偏離直線向吸光度軸彎曲（正偏離）。在光度法中應(yīng)避免溶液產(chǎn)生膠體或混濁。,61,,由于溶液本身的化學(xué)反應(yīng)引起的偏離溶液中的吸光物質(zhì)常因解離、絡(luò)

26、合、締合、形成新化合物或互變異構(gòu)等化學(xué)變化而改變其濃度，因而導(dǎo)致偏離朗伯—比爾定律。由于溶液中各吸光物質(zhì)質(zhì)點(diǎn)間的相互作用,62,二、吸光度測(cè)量引起的誤差,儀器測(cè)量不準(zhǔn)確，如光源不穩(wěn)定、實(shí)驗(yàn)條件偶然變動(dòng)、讀數(shù)不準(zhǔn)確等。對(duì)于同一儀器，讀數(shù)的波動(dòng)對(duì)透射比為一定值；而對(duì)吸光度讀數(shù)波動(dòng)不為定值。,63,,,當(dāng)A=0.434(或透射比T=36.8%)時(shí)，測(cè)量的相對(duì)誤差最小。待測(cè)溶液的透射比T在15%~65%之間，或使吸光度A在0.2~0.8之間

27、，才能保證測(cè)量的相對(duì)誤差較小。,64,§7.4 應(yīng)用,鐵的測(cè)定：,pH=5顯色，?max＝508nm，?＝1.1×104L?mol-1?cm-1,65,,,,硅鉬藍(lán)法測(cè)定微量SiO2,pH0.5~2顯色，提高溫度可加快硅鉬黃形成，?max＝810nm，通常在620～660nm測(cè)定。PO43-、AsO43-有干擾（F-）,66,,,鈦的測(cè)定（H2O2法）,H2SO4介質(zhì)顯色，?max＝410nm，?＝720L?m

28、ol-1?cm-1,干擾：Fe3+－H3PO4V 、W、 Mo 、U有干擾，但一般樣品中不存在。,67,弱酸和弱堿解離常數(shù)的測(cè)定,,68,本章小結(jié),概述物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收光吸收基本定律比色分析和分光光度法及其儀器,69,,示差吸光光度法Differential Spectrophotometry原理：吸光度差與這兩種溶液的濃度差成正比。以把空白溶液作為參比的稀溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線作為ΔA和Δc的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)測(cè)得的ΔA求出相應(yīng)

29、的Δc值，從cx=c0+c可求出待測(cè)試液的濃度，這就是示差吸光光度法定量的基本原理。,70,,示差吸光光度法的誤差Δc(即cx-c0)，測(cè)量誤差為x%， 結(jié)果為cx±(cx-c0)×x%； 普通光度法的結(jié)果為cx±cx·x%。因cx只是稍大于c0，故cx總是遠(yuǎn)大于Δc，故示差吸光光度法的準(zhǔn)確度高。參比溶液的濃度越接近待測(cè)試液的濃度，測(cè)量誤差越小，最小誤差可小于0.3％。標(biāo)尺擴(kuò)展：,71,,雙波

30、長(zhǎng)吸光光度法（dual-wavelength Spectrophotometry）使兩束不同波長(zhǎng)的單色光以一定的時(shí)間間隔交替地照射同一吸收池，測(cè)量并記錄兩者吸光度的差值。這樣就可以從分析波長(zhǎng)的信號(hào)中扣除來自參比波長(zhǎng)的信號(hào)，消除各種干擾，得待測(cè)組分的含量。分析方法的靈敏度、選擇性及測(cè)量的精密度高。被廣泛用于環(huán)境試樣及生物試樣的分析。 ΔA與吸光物質(zhì)濃度成正比。這是定量的理論依據(jù)。只用一個(gè)吸收池，以試液本身對(duì)某一波長(zhǎng)的光的吸光度為參比，

31、消除了因試液與參比液及兩個(gè)吸收池之間的差異引起的測(cè)量誤差，提高測(cè)量的準(zhǔn)確度。,72,,,73,,雙波長(zhǎng)吸光光度法的應(yīng)用混濁試液中組分測(cè)定 ：一般選擇待測(cè)組分的最大吸收波長(zhǎng)為測(cè)量波長(zhǎng)(λl)，選擇與其相近而兩波長(zhǎng)相差在40~60 nm范圍內(nèi)且有較大的ΔA值的波長(zhǎng)為參比波長(zhǎng)。單組分的測(cè)定 ：進(jìn)行單組分的測(cè)定，以絡(luò)合物吸收峰作測(cè)量波長(zhǎng)，參比波長(zhǎng)的選擇有：以等吸收點(diǎn)為參比波長(zhǎng); 以有色絡(luò)合物吸收曲線下端的某一波長(zhǎng)作為參比波長(zhǎng)；以顯色劑的吸收

32、峰為參比波長(zhǎng)。兩組分共存時(shí)的分別測(cè)定：當(dāng)兩種組分的吸收光譜有重疊時(shí)，要測(cè)定其中一個(gè)組分就必須消除另一組分的光吸收。對(duì)于相互干擾的雙組分體系，它們的吸收光譜重疊，選擇參比波長(zhǎng)和測(cè)定波長(zhǎng)的條件是:待測(cè)組分在兩波長(zhǎng)處的吸光度之差ΔA要足夠大，干擾組分在兩波長(zhǎng)處的吸光度應(yīng)相等，這樣用雙波長(zhǎng)法測(cè)得的吸光度差只與待測(cè)組分的濃度成線性關(guān)系，與干擾組分無(wú)關(guān)，從而消除了干擾。,74,,導(dǎo)數(shù)分光光度法（Derivative Spectrometry）,7

33、5,,絡(luò)合物組成的測(cè)定飽和法(又稱摩爾比法) 固定一種組分(通常是金屬離子M)的濃度，改變絡(luò)合劑(R)的濃度，得到一系列[R]/[M]比值不同的溶液，并配制相應(yīng)的試劑空白作參比液，分別測(cè)定其吸光度。以吸光度A為縱坐標(biāo)，[R]/[M]為橫坐標(biāo)作圖。連續(xù)變化法(又稱等摩爾系列法)cM+cR=c，改變cM和cR的相對(duì)量，配制一系列溶液，在有色絡(luò)合物的最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)量這一系列溶液的吸光度。當(dāng)溶液中絡(luò)合MRn濃度最大時(shí)，cR/cM