紫外分光光度法

1、紫外-可見(jiàn)分光光度法講議,,第一節(jié) 紫外-可見(jiàn)分光光度法,研究物質(zhì)在紫外光、可見(jiàn)光光區(qū)的分子吸收光譜的分析方法稱(chēng)為紫外-可見(jiàn)分光光度法。 紫外—可見(jiàn)分光光度法是利用某些物質(zhì)的分子吸收在200 ~ 800 nm光譜區(qū)的輻射來(lái)進(jìn)行分析測(cè)定的方法，廣泛用于無(wú)機(jī)和有機(jī)物質(zhì)的定性和定量測(cè)定。,第二節(jié) 光吸收基本定律和吸收系數(shù),1.光吸收基本定律： 比爾—郎伯（Beer—Lambert）定律為光吸收基本定律，

2、是分光光度分析的理論基礎(chǔ)。 Lambert于1730年提出了光強(qiáng)度與吸收介質(zhì)厚度的關(guān)系。1852年Beer提出了光強(qiáng)度與吸收介質(zhì)中吸光物質(zhì)濃度之間的關(guān)系。,透光率： 單色光通過(guò)一物質(zhì)的溶液時(shí)透過(guò)光的強(qiáng)度（I）與入射光的強(qiáng)度（I0)之比稱(chēng)為透光率或透射比（T）。 T ＝ I ／ I0吸收度： 透光率的負(fù)對(duì)數(shù)稱(chēng)為吸收度或光密度。

3、 A=log1/T=－logT,郎伯（Lambert）定律: 當(dāng)溶液濃度不變時(shí)，吸收度與溶液的液層厚度成正比。比爾（Beer）定律： 當(dāng)溶液液層厚度不變時(shí)，吸收度與溶液的濃度成正比。,郎伯—比爾（Lambert— Beer ）定律: 單色光通過(guò)一物質(zhì)的溶液時(shí)，如果入射光的強(qiáng)度不變，溶液吸收度（A）與溶液濃度（C）和液層厚度（L）成正比。 A=log1/T=EC

4、L 式中E為吸收系數(shù),2.吸收系數(shù)： 定義：吸光物質(zhì)在單位濃度和單位液層厚度時(shí)的吸收度。 表示方法：（1）百分吸收系數(shù)（E）： 當(dāng)溶液濃度（C）為1%（g/ml），光路長(zhǎng)度（L）為1cm時(shí)，相應(yīng)的吸收度為百分吸收系數(shù)，以E表示。 E=A/C(%)×L(cm)中國(guó)藥典規(guī)定的吸收系數(shù)即為E。,（2）摩爾吸收系數(shù)（ε）： 當(dāng)溶液的

5、濃度（C）為1mol/L,光路長(zhǎng)度（L）為1cm時(shí)，相應(yīng)的吸收系數(shù)為摩爾吸收系數(shù)，以ε表示。 　　 ε =A/C(mol/L)×L(cm)ε和E的關(guān)系是： ε=E×分子量/10 E= ε ×10/分子量,第三節(jié).分光光度計(jì)組成,基本原理框圖：,光 源,單色器,吸收池,檢測(cè)器,訊號(hào)處理及顯示器,,,,,（一）光源,可見(jiàn)光區(qū)，常用鎢燈做為光源，可使用的范圍在340 ~ 2500

6、nm?！　∽贤夤鈪^(qū)，常用氫燈或氘燈做為光源?？墒褂玫姆秶?60 ~ 375 nm?！　x器必須配有穩(wěn)壓裝置。,（二）單色器,單色器是能從光源輻射的復(fù)合光中分出單色光的光學(xué)裝置，其主要功能：產(chǎn)生光譜純度高的波長(zhǎng)且波長(zhǎng)在紫外可見(jiàn)區(qū)域內(nèi)任意可調(diào)?！　　∧墚a(chǎn)生單色光的色散元件主要是: 棱鏡和光柵。,（三.）吸收池： 吸收池用于盛放分析試樣，一般有石英和玻璃材料兩種。為減少光的損失，吸收池的光學(xué)面必須完全垂直于光束方向。

7、在高精度的分析測(cè)定中（紫外區(qū)尤其重要），吸收池要挑選配對(duì)。因?yàn)槲粘夭牧媳旧淼奈馓卣饕约拔粘氐墓獬涕L(zhǎng)度的精度等對(duì)分析結(jié)果都有影響。,玻璃吸收池因?yàn)槟芪兆贤夤?，故只能用?20nm以上的可見(jiàn)光區(qū)?！　　∈⑽粘匾虿晃兆贤夤舛Ｓ糜?00nm以下的紫外光區(qū)，但也可用于可見(jiàn)光區(qū)。 最常用的光路長(zhǎng)度為: 1cm的吸收池。,（四.）檢測(cè)器： 檢測(cè)器的功能是檢測(cè)信號(hào)、測(cè)量單色光透過(guò)溶液后光強(qiáng)度變化，是

8、將光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電信號(hào)的一種裝置。,紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)的校正,波長(zhǎng)校正－用汞燈、氘燈、鈥玻璃吸光度準(zhǔn)確度－用重鉻酸鉀的硫酸溶液雜散光檢查－1%碘化鈉溶液、5%亞硝酸鈉溶液,第四節(jié) 樣品測(cè)定操作方法,一.吸收系數(shù)測(cè)定（性狀項(xiàng)下）: 按各該品種項(xiàng)下規(guī)定的方法配制供試品溶液，在規(guī)定的波長(zhǎng)測(cè)定其吸收度，并計(jì)算吸收系數(shù)，應(yīng)符合規(guī)定范圍。,二.鑒別及檢查: 按各該品種項(xiàng)下的規(guī)定，測(cè)定供試品溶液在有關(guān)波長(zhǎng)處的最大及

9、最小吸收，有的并須測(cè)定其各最大吸收峰值或最大吸收與最小吸收的比值，均應(yīng)符合規(guī)定。,三.含量測(cè)定:1.對(duì)照品比較法 : 按各該品種項(xiàng)下規(guī)定的方法，分別配制供試品溶液和對(duì)照品溶液，對(duì)照品溶液中所含被測(cè)成分的量應(yīng)為供試品溶液中被測(cè)成分標(biāo)示量的（100士10）％以?xún)?nèi)，用同一溶劑，在規(guī)定的波長(zhǎng)處測(cè)定供試品溶液和對(duì)照品溶液的吸收度。,2.吸收系數(shù)法 按各該品種項(xiàng)下配制供試品溶液，在規(guī)定的波長(zhǎng)及該波長(zhǎng)士２nm處測(cè)定其

10、吸光度，按各該品種在規(guī)定條件下給出的吸收系數(shù)計(jì)算含量。 采用吸收系數(shù)法應(yīng)對(duì)儀器進(jìn)行校正后測(cè)定。,3.計(jì)算分光光度法 采用計(jì)算分光光度法的品種，應(yīng)嚴(yán)格按各該品種項(xiàng)下規(guī)定的方法進(jìn)行，用本法時(shí)應(yīng)注意：有一些吸光度是在供試品或其成分吸收曲線(xiàn)的上升或下降陡坡部處測(cè)定，影響精度的因素較多，故應(yīng)仔細(xì)操作，盡量使測(cè)定供試品和對(duì)照品的條件一致，若該品種不用對(duì)照品，如維生素A測(cè)定法（見(jiàn)中國(guó)藥典附錄），則應(yīng)在測(cè)定前對(duì)儀器作仔細(xì)的

11、校正和檢定,第五節(jié) 注意事項(xiàng),1.試驗(yàn)中所用的量瓶，移液管均應(yīng)經(jīng)檢定校正、洗凈后使用。2.使用的石英吸收池必須潔凈。吸收池在測(cè)定樣品溶液前必須加以校正。 取吸收池時(shí)，手指拿毛玻璃面的兩側(cè)。裝盛樣品溶液以池體積的4／5為度。 使用揮發(fā)性溶液時(shí)應(yīng)加蓋。吸收池透光面要用擦鏡紙由上而下擦拭干凈，檢視應(yīng)無(wú)殘留溶劑。,吸收池放入樣品室時(shí)應(yīng)注意每次放入方向相同。吸收池使用后應(yīng)用溶劑及水沖洗干凈，晾干防塵保存。吸收池如污染不易洗凈

12、時(shí)可用硫酸發(fā)煙硝酸（3:1V/V）混合液稍加浸泡后，洗凈備用。如用鉻酸鉀清潔液清洗時(shí)，吸收池不宜在清潔液中長(zhǎng)時(shí)間浸泡，否則清潔液中的鉻酸鉀結(jié)晶會(huì)損壞吸收池的光學(xué)表面，并應(yīng)充分用水沖洗，以防鉻酸鉀吸附于吸收池表面。,3. 測(cè)定前應(yīng)先檢查所用的溶劑在測(cè)定供試品所用的波長(zhǎng)附近是否符合要求。 可用1cm石英吸收池盛溶劑以空氣為空白（即參比光路中不放置任何物質(zhì)），測(cè)定其吸光度，應(yīng)符合下表規(guī)定。 所用溶劑應(yīng)不超過(guò)其截止使用波長(zhǎng)。

13、 每次測(cè)定時(shí)所用的溶劑，應(yīng)采用同一廠牌批號(hào)，混合均勻的溶劑。,對(duì)溶劑的要求,溶劑的使用范圍不能小于截至使用波長(zhǎng)，如甲醇、乙醇的截至使用波長(zhǎng)是205nm。在使用前應(yīng)檢查所用溶劑在供試品測(cè)定的波長(zhǎng)處是否符合要求（以空氣為空白）。220～240nm 吸光度≤0.40241～250nm 吸光度≤0.20251～300nm 吸光度≤0.10300nm以上 吸光度≤0.05,4 .稱(chēng)量應(yīng)按藥典規(guī)定

14、要求。配制測(cè)定溶液時(shí)稀釋轉(zhuǎn)移次數(shù)應(yīng)盡可能少，轉(zhuǎn)移稀釋時(shí)所取溶積一般應(yīng)不少于5ml。含量測(cè)定供試品應(yīng)稱(chēng)取2份，如為對(duì)照品比較法，對(duì)照品一般也應(yīng)稱(chēng)取2份，平行操作，每份結(jié)果對(duì)平均值的偏差應(yīng)在±0.5%以?xún)?nèi)。作鑒別或檢查可取樣品1份。,5. 供試品測(cè)試溶液的濃度，除各該品種項(xiàng)下已有注明者外，供試品溶液的吸光度以在0.3～0.7之間為宜，吸光度讀數(shù)在此范圍誤差較小，并應(yīng)結(jié)合所用儀器吸收度線(xiàn)性范圍，配制合適的讀數(shù)濃度。,6.選用儀器的狹

15、縫譜帶寬度應(yīng)小于供試品吸收帶的半寬度，否則測(cè)得的吸光度值會(huì)偏低，狹縫寬度的選擇應(yīng)以減小狹縫寬度時(shí)供試品的吸光度不再增加為準(zhǔn)，對(duì)于中國(guó)藥典紫外測(cè)定的大部分品種，可以使用2nm縫寬，但對(duì)某些品種如青霉素鉀及鈉的吸光度檢查則需用1nm縫寬或更窄，否則其264nm的吸光度會(huì)偏低。,7 .測(cè)定時(shí)除另有規(guī)定者外，應(yīng)在規(guī)定的吸收峰±2nm處，再多測(cè)幾個(gè)點(diǎn)的吸光度，以核對(duì)供試品的吸收峰位置是否正確，并以吸光度最大的波長(zhǎng)作為測(cè)定波長(zhǎng)。除另有規(guī)定

16、外吸光度最大波長(zhǎng)應(yīng)在該品種項(xiàng)下規(guī)定的波長(zhǎng)±２nm以?xún)?nèi)，否則應(yīng)考慮試樣的同一性、純度以及儀器波長(zhǎng)的準(zhǔn)確度。,第七節(jié) 檢驗(yàn)記錄單內(nèi)容,檢品名稱(chēng)：多潘立酮片 批 號(hào)：070524檢品編號(hào)：200703634 檢驗(yàn)項(xiàng)目：含量測(cè)定檢驗(yàn)依據(jù)：中國(guó)藥典2005年版二部附錄ⅣA 紫外分光光度計(jì)編號(hào)： 檢驗(yàn)日期：天平編號(hào)： 稱(chēng)量日期：室 溫：

17、 相對(duì)濕度：檢測(cè)條件：檢測(cè)波長(zhǎng) nm 狹縫寬度 2.0 nm標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定：含多潘立酮應(yīng)為標(biāo)示量的90.0%～110.0％空白溶劑檢查,第七節(jié) 檢驗(yàn)記錄單內(nèi)容,對(duì)照品溶液配制：取多潘立酮對(duì)照品約12.5mg，精密稱(chēng)定，置25ml量瓶中，加水2.5ml與異丙醇12.5 ml，置水浴上加熱溶解，冷卻，加異丙醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 ml，置25 ml量瓶中，加異丙醇至刻度, 振搖。供試品溶液配制：

18、取本品20片，精密稱(chēng)定，研細(xì)，精密稱(chēng)取約相當(dāng)于多潘立酮10mg的量，置50ml量瓶中，加水5ml，振搖，加異丙醇25 ml，置水浴上加熱10分鐘并時(shí)時(shí)振搖使溶解，放冷，加異丙醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 ml，置50 ml量瓶中，加異丙醇至刻度, 振搖。,第七節(jié) 檢驗(yàn)記錄單內(nèi)容,測(cè)定方法：取上述二溶液，在288nm的波長(zhǎng)處分別測(cè)定吸光度。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)名稱(chēng): 批號(hào)：