苯酚降解菌

1、苯酚降解菌苯酚降解菌23鄰苯二酚雙加氧酶基因克隆和序列分析鄰苯二酚雙加氧酶基因克隆和序列分析一摘要：摘要：環(huán)境中的酚污染主要指酚類化合物對水體的污染，通常含酚廢水中又以苯酚和甲酚的含量最高。目前環(huán)境監(jiān)測常以苯酚和甲酚等揮發(fā)性酚作為污染指標。苯酚廣泛存在于石油、化工、煤氣、焦化、鋼鐵及酚類生產(chǎn)廠排放的廢水中。含酚廢水的排放導致水源污染毒死魚蝦危害農(nóng)作物并嚴重威脅人類的健康在我國水污染控制中已被列為重點解決的有害廢水之一。含酚有機物的毒性還

2、在于其只能被少數(shù)微生物所分解。在油田地層水中分離出苯酚降解菌BF80，并且從BF80中克隆出編碼2，3鄰苯二酚雙加氧酶(參與苯酚降解所必須的一種酶)的基因序列；采用基因克隆的策略是通過PCR進行片段克隆，并用UNIQ10柱形DNA回收試劑盒回收產(chǎn)物，采用NCBIBLAST序列分析表明該基因片段長1207bp序列比較分析表明該基因片段與2苯酚羥化酶A相似度達88%，氨基酸序列分析表明其與23鄰苯二酚雙加氧酶相似度達96%。本實驗研究編碼降

3、解苯酚的23鄰苯二酚雙加氧酶的基因克隆及序列分析，為構(gòu)建高效降解苯酚的基因工程菌奠定了基礎(chǔ)。Phenoldegradingbacteria2phenolhydroxylasegenesequenceanalysisAbstract:Phenolpollutionintheenvironmentmainlyreferstophenoliccompoundsonwaterpollutionwastewatercontainingphenol

4、isusuallyturnedaroundthehighestlevelsofphenolcresol.OftenpresentenvironmentalmonitingsuchasphenolcresolPhenolaspollutionindicats.Phenolwidespreadinthepetroleumchemicalgascokesteelphenolicwastewaterplantemissions.Phenolic

5、wastewateremissionsofwaterpollutionpoisonedfishdamagecropsaseriousthreattohumanhealthwaterpollutioncontrolinChinahasbeenakeytosolveoneoftheharmfulwaste.Thetoxicityofphenolganicsstillonlyasmallnumberofmicroganismstheirdec

6、omposition.InoilfieldwaterofphenoldegradingbacteriaisolatedfromBF80BF80wasclonedfromthe23catecholdioxygenase(involvedinphenoldegradationofanenzymenecessary)ofthegenesequenceusinggenecloningstrategywereclonedbyPCRwithUNIQ

7、10columnDNAextractionkitrecyclingproductsusingNCBIBLASTsequenceanalysisshowedthatthegenefragmentwas1207bpSequenceanalysisshowedthatthegenefragment2Asimilaritytophenolhydroxylase88%aminoacidsequenceanalysisshowedthatwith2

8、3catecholdioxygenasesimilarityof96%.Thisstudycodeddegradationofphenol23CatecholDioxygenaseGeneCloningsequenceanalysisindertobuildefficientgeicengineeringofbacteriadegradingphenolbasis關(guān)鍵詞：關(guān)鍵詞：苯酚苯酚苯酚降解菌苯酚降解菌基因克隆基因克隆基因序列分析基

9、因序列分析降解率幾乎沒有影響，但Ca2降低其降解速率，而Mg2可提高嗜熱菌BF80的苯酚降解速率；05%濃度的酵母粉最適合BF80的生長，可使其最大生長量達到1563（參見文獻23），本次試驗展開對嗜熱菌BF80苯酚降解菌研究，獲得對編碼該菌降解苯酚所需的酶基因的序列和氨基酸序列進行分析，為其對苯酚降解機理提供依據(jù)。三、材料與方法三、材料與方法1、嗜熱菌BF80由油田地層水中分離得到；2、菌種活化：取BF80菌苔一環(huán)于20ml于LB液體

10、培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)24h，離心分離菌體，用生理鹽水洗滌2次，懸于10ml的生理鹽水中3、用SDS裂解法大量制備菌株BF80總DNA；4、設(shè)計引物：根據(jù)GanBank數(shù)據(jù)課公布的序列設(shè)計二對兼并引物一、二（表1）；5、對基因片段進行PCR以獲得目的片段；（1）PCR反應(yīng)體系：PCR反應(yīng)體系由生工提供的50微升體系：Taq酶（0.25微升），dntp（10mmoll）Mg2（25mmoll）boffer（15微升），引物1（1微升），引物2

11、（1微升），去離子水（36.75微升）（2）PCR程序：變性溫度95℃；退火溫度50℃、30s；復(fù)性溫度72℃、10min，共30個循環(huán)；40℃無限循環(huán)；（3）；①PCR產(chǎn)物的檢測：用0.9%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物大小及其特異性（結(jié)果顯示于圖1）；②PCR產(chǎn)物回收（UNIQ10柱形DNA回收試劑盒回收產(chǎn)物）6、將目的片段連接到載體并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌（1）以E.coilDH5a作為DNA操作時用的受體菌；（2）感受態(tài)細胞的制備①液氮

12、或低溫冰箱中取出大腸桿菌DH5a，在LB平板上劃線。37攝氏度過夜至全長出菌落；②挑直徑13mm的單菌落多個，接種到250ml錐形瓶的SOB培養(yǎng)基培養(yǎng)基不可再多，會影響效率；③在18℃、150250rmin培養(yǎng)1950小時（沒有冷卻的藥床可在室溫進行），溫度不可超過37℃；④OD600約0.40.8時培養(yǎng)放在冰水中冷卻10min；⑤在4攝氏度、300rmin離心15h回收菌體；⑥去掉上清后用13體積的冷TB溶液懸浮，冷10min；⑦再次