細(xì)胞培養(yǎng)操作步驟

1、培養(yǎng)基的配置：基礎(chǔ)培養(yǎng)基500ml胎牛血清50ml雙抗5ml凍存液的配置：DMSO18ml胎牛血清2ml。依次比例酌量配置。超凈工作臺(tái)常規(guī)配置移液器1套（2.5μl、20μl、200μl、1ml），酒精燈1盞，液器1臺(tái)，斜架1臺(tái)，酒精噴壺1個(gè)，酒精棉球缸1個(gè)，污缸1個(gè)，常規(guī)耗材：培養(yǎng)瓶（50㎝2），定量移液管（5ml、10ml），槍頭（1ml、200μl、10μl），培養(yǎng)皿，6244896孔板，醫(yī)用脫脂棉球，保種管所需試劑：gibco高

2、糖培養(yǎng)基，胎牛血清，雙抗，DMSO，胰酶，苯扎溴氨，75%酒精……實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：所需的各項(xiàng)高壓后的耗材放于超凈工作臺(tái)內(nèi)，用酒精噴壺噴灑實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，并關(guān)閉工作臺(tái)打開紫外燈照射30min后開始實(shí)驗(yàn)操作。首次傳代前細(xì)胞的復(fù)蘇，首先用一大燒杯盛滿37℃的溫水放于液氮罐旁邊，待細(xì)胞株取出后留上端13于37℃水面上盡最大速搖動(dòng)管使其在2min內(nèi)迅速融化。若種管頂部含有凍存的細(xì)胞液在搖動(dòng)期間用力甩動(dòng)使其降于管底后再搖動(dòng)。這一過程可在超凈工作臺(tái)外操作。實(shí)驗(yàn)

3、步驟一、原代細(xì)胞的培養(yǎng)1.紫外消毒30min后關(guān)閉紫外燈，開啟超凈臺(tái)正常工作狀態(tài)，用酒精消毒操作者的雙手。2.將所需的培養(yǎng)基確保瓶身干凈后放于工作臺(tái)面內(nèi)，點(diǎn)燃酒精燈，將培養(yǎng)基瓶口用酒精棉球擦拭后，再將瓶口對(duì)準(zhǔn)在酒精燈上消毒23次，旋開瓶蓋后再次分別消毒瓶口和瓶蓋，分別放于酒精燈的兩側(cè)。特別是將培養(yǎng)基瓶放于斜架上，瓶口對(duì)準(zhǔn)酒精燈，且放在距離酒精燈最近的位置，瓶蓋置于酒精燈的另一側(cè)。3.取1個(gè)高壓后的新培養(yǎng)瓶，瓶口在酒精燈上消毒23次，旋開

4、后分別再次消毒瓶口和瓶蓋23次分別放于酒精燈兩側(cè)，把保種管在超凈臺(tái)外用酒精棉球擦拭下23后拿進(jìn)超凈臺(tái)內(nèi)在酒精燈上消毒保種管口23次放于臺(tái)面左手邊，取1ml移液器快速移動(dòng)在酒精燈上消毒12次，然后再裝上槍頭吸取保種管內(nèi)的細(xì)胞液，懸空移入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。4.拿出1支高壓后的5ml定量移液管，在酒精燈上灼燒尾部后裝于電動(dòng)移液器上，再次放于酒精燈上灼燒整個(gè)定量移液管管身23次，懸空進(jìn)入培養(yǎng)基瓶?jī)?nèi)吸取4ml培養(yǎng)基再懸空移入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，將培養(yǎng)瓶瓶口和瓶蓋在

5、酒精燈上消毒23次后擰緊平放，在瓶身做好實(shí)驗(yàn)標(biāo)記。5.將培養(yǎng)基瓶口和瓶蓋消毒23次后擰緊，熄滅酒精燈，整理實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，取出實(shí)驗(yàn)試劑及污缸等，關(guān)閉超凈工作臺(tái)。6.將培養(yǎng)瓶放于28℃5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，旋開瓶口少許。注意整個(gè)培養(yǎng)箱底托盤內(nèi)一定要放高壓后的水，且定期更換確保無菌。在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1012h，瓶蓋擰緊后拿出培養(yǎng)箱，置于熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁情況，及細(xì)胞形態(tài)。最后更換培養(yǎng)液。胞盡可能處于單個(gè)懸浮狀態(tài)。6.取2或3個(gè)高

6、壓后的新培養(yǎng)瓶，瓶口在酒精燈上消毒23次，旋開后分別再次消毒瓶口和瓶蓋23次分別放于酒精燈兩側(cè)，然后將細(xì)胞培養(yǎng)基均勻的分到3或4個(gè)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)（注意原來傳代時(shí)使用的培養(yǎng)瓶可繼續(xù)傳代使用），進(jìn)行1傳3或1傳4的培養(yǎng)。7.拿出1支高壓后的5ml定量移液管，在酒精燈上灼燒尾部后裝于電動(dòng)移液器上，再次放于酒精燈上灼燒整個(gè)定量移液管管身23次，懸空進(jìn)入培養(yǎng)基瓶?jī)?nèi)吸取4ml培養(yǎng)基懸空移入每個(gè)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，將培養(yǎng)瓶瓶口和瓶蓋在酒精燈上消毒23次后擰緊平放，在

7、瓶身做好實(shí)驗(yàn)標(biāo)記。8.將培養(yǎng)基瓶口和瓶蓋消毒23次后擰緊，熄滅酒精燈，整理實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，取出實(shí)驗(yàn)試劑及污缸等，關(guān)閉超凈工作臺(tái)。9.將培養(yǎng)瓶放于28℃5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，旋開瓶口少許。注意整個(gè)培養(yǎng)箱底托盤內(nèi)一定要放高壓后的水，且定期更換確保無菌。每天定時(shí)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，一般7296h后，細(xì)胞生長(zhǎng)密度大于90%，即可進(jìn)行細(xì)胞的傳代或保株。四、細(xì)胞株的保存1.紫外消毒30min后關(guān)閉紫外燈，開啟超凈臺(tái)正常工作狀態(tài)，用酒精消毒操作者的雙手。

8、2.將所需的培養(yǎng)基，胰酶確保瓶身干凈后放于工作臺(tái)面內(nèi)，點(diǎn)燃酒精燈，將培養(yǎng)基和胰酶瓶口用酒精棉球擦拭后，再將瓶口對(duì)準(zhǔn)在酒精燈上消毒23次，旋開瓶蓋后再次分別消毒瓶口和瓶蓋，分別放于酒精燈的兩側(cè)。特別是將培養(yǎng)基瓶放于斜架上，瓶口對(duì)準(zhǔn)酒精燈，且放在距離酒精燈最近的位置，瓶蓋置于酒精燈的另一側(cè)。3.將培養(yǎng)瓶瓶口在酒精燈上消毒23次，旋開后分別再次消毒瓶口和瓶蓋23次，蓋放于酒精燈右側(cè)后將培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)液懸空倒進(jìn)污缸，在酒精燈消毒23次瓶口，豎直

9、放好。取1ml移液器快速移動(dòng)在酒精燈上消毒12次，然后再裝上槍頭吸取1.5ml胰酶液，懸空移入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。4.將培養(yǎng)使胰酶浸沒整個(gè)瓶壁的細(xì)胞層，計(jì)時(shí)約40s，立馬豎起對(duì)著燈光可觀察到細(xì)胞與細(xì)胞之間有針孔樣縫隙，并有12個(gè)細(xì)胞脫落，這時(shí)為胰酶消化的最適時(shí)機(jī)。若看到成片的細(xì)胞從瓶壁脫落為胰酶消化過度；若看不到針孔樣縫隙和細(xì)胞脫落，則需繼續(xù)消化，輕輕的迅速平放培養(yǎng)瓶使胰酶浸沒細(xì)胞層1s后迅速豎起對(duì)著燈光觀察細(xì)胞情況，可反復(fù)幾次，直至出現(xiàn)針孔樣縫

10、隙和12個(gè)細(xì)胞脫落的最佳消化狀態(tài)。用移液器將胰酶吸凈。5.吸取1ml細(xì)胞凍存液于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，并用移液器吸取少量的培養(yǎng)基輕柔的反復(fù)沖洗培養(yǎng)瓶壁58次，使貼壁細(xì)胞完全脫落于培養(yǎng)基內(nèi)再輕輕吹打23次，使細(xì)胞盡可能處于單個(gè)懸浮狀態(tài)。6.將1ml含有細(xì)胞的凍存液移入新的保種管內(nèi)，擰緊瓶蓋，做好實(shí)驗(yàn)標(biāo)記。7.將培養(yǎng)基瓶口和瓶蓋消毒23次后擰緊，熄滅酒精燈，整理實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，取出實(shí)驗(yàn)試劑及污缸等，關(guān)閉超凈工作臺(tái)。8.將保種管先放于4℃冰箱30min后拿出放